补阳还五颗粒有效部位质量控制及药效研究

一、研究目的：本研究课题以科学合理的改进优化和完善补阳还五汤中有效部位的制备工艺,并进行以有效部位提取物重新组方的“补阳还五颗粒”的药效学实验研究为主要目标,通过测定缺血性脑中风模型大鼠在给药前、后脑内阿片肽类物质,即血浆中强啡呔Al-β样免疫活性物质(ir-DynAl-β),神经肽Y(NPY)的水平；血液因子类物质：β-血栓球蛋白(β-TG),血小板因子4(PF-4)的水平；血液流变学指标,包括：血沉、纤维蛋白原、红细胞压积、全血粘度、血浆粘度、全血还原粘度、红细胞电泳时间等的变化；观察大鼠大脑海马区神经元形态结构的变化,以脑心通胶囊(步长制药有限公司)作为阳性对照药,来观察、验证新型补阳还五颗粒对缺血性脑中风的疗效。同时采用昆明小鼠做急性毒性实验,重新再观察新型补阳还五颗粒的安全性,为临床安全用药提供科学的理论依据。二、研究方法：(一)补阳还五汤有效部位提取物的质控及其复方颗粒的制备研究根据补阳还五汤复方中黄芪、当归尾、川芎、赤芍、桃仁、红花和地龙,各个药物的理化性质不同,采用相应的提取溶剂和提取、纯化方法进行处理,选用高效液相色谱法对君药有效部位中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮和臣药有效部位中阿魏酸的质量进行控制,再按照中医药理论“君、臣、佐、使”的组方原则,以特定的比例组方,制备成“补阳还五颗粒”。(二)缺血性中风动物模型的制备200只健康雄性SPF级大鼠,体重280～300g,适应性饲养两周,称量并记录所有大鼠体重,随机抽取8只做空白对照组,采用改良Pulsinelli四血管闭塞法进行手术处理其余的大鼠,复制临床缺血性中风动物模型。(三)补阳还五颗粒治疗缺血性中风的药效评价造模成功存活大鼠随机分为4组,缺血性中风模型组；缺血性中风脑心通治疗组(阳性对照组)；缺血性中风补阳还五颗粒30.4g/kg治疗组(高剂量组)；缺血性中风补阳还五颗粒15.2g/kg治疗组(中剂量组),并设空白对照组和假手术组。灌服药物后,所有大鼠腹主动脉取血,取2.Oml注入枸橼酸钠1：9配比的抗凝管中,混匀分离血浆,用Sysmex CA7000(日本),凝血酶法测定血浆纤维蛋白原的含量,用竞争性抑制法酶联免疫吸附实验技术测定血浆中β-血栓球蛋白(β-TG),血小板因子4(PF-4)的水平；强啡肽(Dyn)、神经肽Y(NPY)的含量。另取2.5ml血液注入肝素钠抗凝管1：9的配比的抗凝管中,混匀后的全血采用赛科希德SA9000(中国,北京)全自动血液流变学分析仪测定全血还原粘度(高切、低切),全血粘度(高切、中切、低切),红细胞沉降率、红细胞比积等,分离血浆,测定血浆粘度。其余血液注入2.0%EDTA.Na2抗凝管中,立即混匀,采用sysmex XE-5000(日本)进行血常规分析。抽完血后的大鼠,剪下头颅,分离大脑,置于固定液中,用于病理分析。(四)急性毒性实验健康KM小鼠,SPF级,体重18-22g,雌雄各半,适应性饲养2周,实验前4-6h禁食不禁水,采用单次口服固定剂量法进行预试验,探明实验下一步走向,是测LD50还是MTD。再根据预试结果安排正式实验,详细观察给药动物的反应及死亡情况,并记录动物的外观、行为活动、精神状况、大小便等情况。连续观察14天后,处死小鼠,解剖观察其心、肝、脾、肾、胸腺、大脑的外观及颜色并称取各脏器的重量计算脏器指数,并将各个脏器用10%中性甲醛固定,做病理切片进一步观察。三、研究结果(一)药物有效部位提取物的质控研究黄芪药材按本实验的方法,经提取、粗分离和纯化,测得黄芪总皂苷粗品和总黄酮类混合物的百分含量为2.83%。经高校液相色谱法分析得出,黄芪甲苷的回归方程：y hat=1.3741x+2.9379, (R2=0.9995,r=0.9997),总皂苷粗品和总黄酮类混合物中黄芪甲苷的含量高达6.39%；毛蕊异黄酮的回归方程：y hat=3476.8x-4375.7, (R2=0.9996,r=0.9998),总皂苷粗品和总黄酮类混合物中毛蕊异黄酮含量为1.34%。(二)缺血性中风动物模型的建立采用改良Pulsinelli四血管闭塞法永久闭塞大鼠的两条椎动脉及颈总动脉后,手术大鼠眼睛发暗,甚至变黑,对外界刺激反应变得迟钝,翻正反射消失；毛发竖立且失去光泽,精神萎靡,动作迟缓,走路打转或转圈,运动时躯体向一侧歪斜。同时伴有体重增长明显减缓等症状,与缺血性中风证候的临床表现基本接近,表明该模型造模成功。经检测,血红蛋白含量、平均RBC血红蛋白浓度都明显降低；血小板总数急剧增高,全血粘度和全血还原粘度,白细胞总数、中性粒细胞总数等升高,血浆中神经肽类物质和血液因子含量也明显升高,和空白对照组及假手术组,进行比较,差异均有统计学意义。显微镜下可见大脑皮质和海马区的神经元细胞形态结构发生明显的改变。因此,该方法能成功复制出临床缺血性中风的疾病模型。(三)补阳还五颗粒治疗缺血性中风的药效评价模型大鼠灌服补阳还五颗粒后,外观表现及精神状态都有一定程度的改善；异常降低血红蛋白含量有所改善；异常升高的血小板总数、血浆纤维蛋白原水平、全血粘度(高切、中切、低切)和全血还原粘度(高切、低切)水平有所恢复,趋近于正常水平；同时生化因子神经肽Y(NPY)和β-血栓球蛋白(β-TG)、强啡肽(Dyn)和血小板因子4(PF4)的水平也明显降低。大脑皮质和海马区的神经元形态也有一定程度的改善。(四)急性毒性实验结果在预试验中,补阳还五颗粒药物浓度为2000mg/kg时,经灌胃给小鼠,当剂量达到6g/kg时,仍不引起动物死亡,表明补阳还五颗粒无急性毒性,测不出LD50,有一个最大耐受剂量指标,测得昆明小鼠通过灌胃服药对补阳还五颗粒的最大耐受量高于6.0g/kg,相当于成人日剂量的82倍。给药组小鼠的肝指数、心脏指数、肺指数、脾指数、肾指数与空白对照组相比较都无明显的差异,表明补阳还五颗粒无明显的靶器官毒害作用,同时安全范围较广。四、结论本课题实验中采用的改良Pulsinelli四血管闭塞法能够成功复制临床的缺血性中风疾病模型,在研的补阳还五颗粒能够改善缺血性中风模型大鼠紊乱的血液流变系统,并能降低与中风密切相关的生化因子的水平,还可以促使大脑神经细胞的修复,从而起到对缺血性中风的治疗作用。同时,该药物无明显急性毒性作用,保证了用药的安全性。此项研究为开发更加安全、低毒、速效、方便服用的复方中成药新产品提供理论依据,为更加科学的指导临床用药奠定基础。