间充质干细胞可有效抑制肝癌细胞的增殖，并促进其凋亡
肝癌是全世界常见的恶性肿瘤,分为原发性肝癌和转移性肝癌,而肝癌又以原发性肝癌中的肝细胞肝癌( HCC) 最为常见｡手术切除是目前根治原发性肝癌的首选治疗手段,因为原发性肝癌手术切除后复发率很高,所以术后一般辅以放化疗治疗｡肝移植是根治原发性肝癌的有效方法,但是目前肝脏来源过少､费用高以及免疫排斥反应等问题存在阻碍肝移植的广泛开展｡
近年来间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 被广泛用于肿瘤方面的研究,科学家们发现供体MSC主要在肿瘤部位聚集｡MSC的这一特性现在被称为肿瘤趋向性( tumor tropism) ｡很多研究表明当MSC在肿瘤组织聚集并与肿瘤细胞接触后,它可能通过以下机制发挥抑制肿瘤的效应:
01在白血病模型中,MSC 通过分泌dickkopf-1(DKK-1)蛋白反向调控Wnt 通路抑制肿瘤细胞的增殖;
02在卡波西肉瘤模型中,MSC 通过抑制PI3K/Akt通路阻止肿瘤细胞的增殖;
03另外一系列体外实验发现MSC不单可以抑制肿瘤细胞的增殖,也可以促进其凋亡｡
科学家发现在有MSC存在的情况下,肝癌细胞c-myc､Bcl-2和PCNA 的表达水平均呈下降趋势,导致增殖活性降低,凋亡水平增加｡MSC还可以诱导并提高细胞周期抑制蛋白p21 的活性,使得肿瘤细胞阻滞于G0/G1期｡
在一项大鼠HCC模型研究中发现注射MSC直接抑制肿瘤组织的生长,改善了肝脏组织表观和功能｡
一项通过体外将人脐带间充质干细胞与人肝癌细胞系HepG2共培养的实验表明,人脐带间充质干细胞具有抑制肝脏肿瘤细胞增殖､促进其凋亡的作用｡实验过程分别对MSC条件培养基处理的HepG细胞活性､凋亡比例､细胞侵袭和黏附能力､细胞增殖通路､信号转导通路进行测定,结果如下:
01 细胞活性测定结果
使用 MSC 条件培养基处理HepG2细胞 24h 后,处理组的细胞活性( 106. 5% ± 1. 0% )明显高于对照组 ( 100. 0% ± 1. 0%) ( P = 0. 000) ｡但是,处理48h后,实验组( 88. 9% ± 1. 2% )明显低于对照组( 100. 0% ± 1. 0% ) ( P = 0. 000) ;72h后实验组HepG2细胞的细胞活性进一步下降( 80.6% ±1.0% )（图1A）｡
图1A
02 调亡比例测定结果
使用MSC条件培养基处理HepG2细胞24h后,处理组与对照组凋亡率差异有统计学意义( 图 1B) ;培养 48h和72h后,处理组的凋亡率都明显高于对照组(图 2) ｡
图1B
03 癌细胞侵袭和黏附能力测定
体外侵袭和黏附能力是癌细胞成瘤性的重要指标｡笔者发现,24h的MSC 条件培养基处理对于HepG2的侵袭能力没有显著影响( P> 0. 05) ｡但是,随着处理时间的增加,48h 和 72h 处理组的侵袭能力相比起对照组显著下降,提示MSC 条件培养基可以有效抑制HepG2的转移能力( 图 2) ｡此外,24h 的 MSC 条件培养基处理对于HepG2 的黏附能力只有少量的影响｡但是当处理时间达到48 或者72h 后,MSC 条件培养基处理显著降低了HepG2 的体外黏附水平( P = 0. 000,图 3)｡
04细胞增殖通路测定
为了检测影响 HepG2细胞增殖的分子标志物,笔者进行了Ki-67蛋白的免疫组化实验｡
结果发现,24hMSC条件培养基处理HepG2细胞并未造成细胞内Ki-67表达量的明显下降｡和细胞活性的结果一样,48和72h处理组的单个细胞内Ki-67 表达量相较于对照组出现了显著的下降( P = 0.000),提示 MSC 条件培养基可能通过下调胞内Ki-67 的表达影响HepG2 的活性｡
另外细胞内组蛋白H3 的磷酸化水平的变化也进一步验证了Ki-67 的定量结果( 图 4) ｡
05 信号转导通路测定
为了进一步研究MSC条件培养基引起HepG2细胞生长阻滞和凋亡的影响,笔者在两条通路中各挑选了两个关键基因进行蛋白表达变化的分析｡在48和72h这两个时间点上, MSC 条件培养基的处理大幅降低了细胞增殖关键蛋白PCNA和 survivin 的表达量,但是大幅增加了细胞凋亡的标志物——激活的caspase-3的表达量｡此外,细胞内抗凋亡标志蛋白 Bcl -2的表达水平被MSC条件培养基处理显著抑制(图5)｡
总结
人脐带间充质干细胞具有抑制肝脏肿瘤细胞增殖､促进其凋亡的作用｡
值得注意的是, MSC由50%密度增殖到100%密度的时间较短(常规培养条件24-36h 便可完成) ｡在如此短的时间内产生的条件培养基就能够显著抑制HepG2 细胞的成瘤性,说明 MSC 在生长过程中很有可能快速分泌一些抑癌物质｡
近期研究发现,DKK-1可能是MSC分泌的最重要的抗肿瘤分子之一｡DKK-1 是Wnt 通路的直接抑制分子,直接作用的主要受体Wnt通路细胞膜上的受体之一-LRP6｡除了白血病,亦有报道指出MSC分泌的DKK-1可以通过抑制Wnt 通路减缓乳腺癌细胞的生长｡