特别关注｜华盛顿大学Crispe实验室×吉林大学第一医院牛俊奇课题组揭秘肝脏Kupffer细胞转分化

近期在European Journal of Immunology上发表的美国华盛顿大学Crispe实验室和吉林大学第一医院肝病科牛俊奇课题组共同合作的题为“A conserved pathway of transdifferentiation in murine Kupffer cells”的研究表明，Kupffer细胞（KCs）可发生转分化并存在保守通路。研究人员创新性利用Emr1Cre+/-::RiboTag+/-小鼠进行KCs谱系追踪，在体外肝脏非实质细胞培养和精密肝切片培养两种不同的体外模型中揭示了KCs可发生转分化，通过多聚体免疫共沉淀富集和免疫荧光成像共聚焦分析了KCs转分化相关的基因，转录因子和蛋白表型的变化。

每年全球约有200万人因慢性肝病死亡[1]，是全球主要的健康负担。防控纤维化进展是预防肝相关死亡的一种重要途径。尽管人们对肝纤维化发生的分子机制有了越来越多的了解，但始终没有被批准的肝纤维化治疗药物[2]。因此，深入探究肝纤维化发生发展中的各种细胞以及分子通路与机制至关重要。

在肝脏感染或损伤的反应中，KCs活化也是重中之重，随着KCs活化而来的炎症反应可保护肝脏免受感染，同时可以限制外部刺激对宿主的细胞和器官损伤。在许多情况下，如醋氨酚毒性和肝细胞修复，KCs都发挥重要的保护或愈合功能。

慢性肝损伤过程中，学界广泛认可的纤维化理论是：持续激活的KCs分泌促炎症和促纤维化细胞因子，作用于肝星状细胞（HSCs）使之转分化形成肌成纤维细胞，最终产生胶原沉积。但在肝脏外的其他组织中，伤口愈合相关的巨噬细胞自身转分化为纤维细胞并分泌胶原蛋白，先前的对肝纤维化的研究主要集中在KCs对HSCs转化的促进作用上，KCs是否可以发生转分化参与肝纤维化尚未阐明。

对KCs的体外研究主要集中在非实质细胞的分离培养方面，依赖于密度梯度离心方法，上述方法无法提供准确的KCs定位，可能混入肝脏中各类其他细胞导致特异性下降，同时由于分离细胞，破坏细胞微环境，损失了KCs和其他细胞的相互作用的关键反应。Crispe实验室创造性的使用Emr1Cre+/-::RiboTag+/-小鼠细胞谱系追踪技术，通过多聚体免疫共沉淀富集可以精确追踪KCs，同时采用精密肝切片培养技术的保留了细胞微环境的相对完整性。

首先，研究人员利用Emr1Cre+/-::RiboTag+/-杂合子小鼠进行KCs谱系追踪，发现体外培养14天后，部分KCs形态发生变化，细胞变形拉长并产生星状突起，同时不再表达F4/80。对体外培养后3天和6天的KCs进行免疫共沉淀富集后基因表达分析， 发现KCs丢失特征基因（Emr1、Clec4f、MerTk、Marco等）。

进一步发现在精密肝切片培养实验中肝片逐渐产生胶原沉积，使用氯膦酸脂质体耗竭KCs后胶原沉积缓解，提示KCs与肝切片中胶原沉积有关。

为进一步探索KCs是否发生转分化，研究人员分别在体外肝脏非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中进行细胞谱系追踪实验，结果表明随着体外培养时间的推移，KCs不仅丢失特征基因（Emr1、MerTk、Clec4f等），调控KCs特征表达的转录因子（Spi1、Spic、Nr1h3等）也出现下调，而肌成纤维细胞或组织成纤维细胞的多个基因（Col1a1、Col1a2、Col3a、Acta2等）表达上调，同时表现出相对应的蛋白表型变化，包括F4/80蛋白丢失，出现FSP1，Col1a1等蛋白表达。

上述效应在非实质细胞培养和肝组织切片培养两种模型中表现出高度一致性，提示KCs的转分化可能是一种保守反应。该项研究表明， KCs自身也可通过转分化为类似成纤维细胞样的细胞，可能直接参与肝纤维化。

培养14天后KCs免疫荧光成像

氯膦酸脂质体耗竭KCs后胶原沉积缓解

KCs转分化示意图

本研究的意义在于，提出了KCs可发生转分化，提供KCs参与肝纤维化可能的新途径，同时为肝纤维化治疗提供了潜在的新靶点。此外，本研究提示了目前KCs的体外实验研究设计的合理性，任何人为设计的KCs体外实验，其结果实际都有可能会叠加在KCs转分化效应上，需要重新审视以往的研究成果。

本研究获得国家留学基金委员会和NIH的资助，此次发表成果的主要实验完成者为李昕宇和李婉玉以及国外研究员Nicole Hollingshead。牛俊奇教授、Ian N. Crispe教授和Radika Soysa博士为共同通讯作者，同时感谢巫峡博士、Alyse Douglass女士、Sarah Lampert研究员和Camtu D. Truong医生为本研究提供的重要帮助。

原文链接：

http://doi.wiley.com/10.1002/eji.202049124

参考文献：

[1] ASRANI S K, DEVARBHAVI H, EATON J, et al. Burden of liver diseases in the world [J]. J Hepatol, 2019, 70(1): 151-171.

[2] SCHUPPAN D, ASHFAQ-KHAN M, YANG A T, et al. Liver fibrosis: Direct antifibrotic agents and targeted therapies [J]. Matrix Biol, 2018, 68-69: 435-451.

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