刘振民：14分钟详解益生菌与胞外多糖

编者按

2021 年 5 月 28~30 日，2021中国肠道大会成功举办，中国肠道产业大会也同期隆重召开。来自先锋肠企的企业家和企业代表的 80 余个产业演讲，为参会者奉上了一道丰盛的肠道产业大餐。

今天我们特别整理发布光明乳业研究院院长刘振民先生题为《功能因子胞外多糖的产生机制及其在益生菌发酵乳中的应用》的现场精彩演讲视频和图文实录，以飨读者。

刘振民：光明乳业研究院院长、乳业生物技术国家重点实验室主任、上海乳业生物工程技术研究中心主任。

教授级高工、博士研究生导师，担任 IDF 中国营养与健康委员会首席专家、国家微生物种业产业技术创新战略联盟理事、上海市食品学会乳品加工委员会主任等，主要研究领域是益生菌、特色奶酪和乳品加工新技术。近年来在 Scientific Reports, International Dairy Journal 等以第一或通讯作者发表 SCI 论文 11 篇；获授权国际发明专利 10 项。担任十二五国家科技支撑计划奶酪课题主持人、十三五国家重点研发计划乳品安全项目首席专家。发明了领先的植物乳杆菌高菌数增殖技术、耐温再制干酪，带领团队开发健能淘金高手发酵乳、每日千亿、75℃ 鲜活优质巴氏杀菌乳、莫斯利安常温果粒酸奶等多项乳制品，取得良好的经济和社会效益。

各位专家，各位同行，大家下午好！我是刘振民，来自光明乳业。

今天我给各位分享的题目是《功能因子胞外多糖的产生机制及其在益生菌发酵乳中的应用》。

胞外多糖呢，大家都知道，是益生菌非常重要的一个代谢产物。它有什么结构？有什么功能？它在益生菌发酵乳中扮演什么样的角色？今天我给各位讨论这么一个课题。

首先，我们先介绍一下研究的背景。益生菌发酵乳，在大健康食品产业中有什么重要的作用呢？我给大家做一个分享。

第一个，是疫情以来消费者对乳制品和健康高度关注。我们可以看到，52%的消费者比以往更加关注健康，关注自身的免疫力，并会购买相关的产品。

那么疫情以后，希望增加哪些食品的消费呢？排在前三位的是：酸奶、肉制品和提高免疫力的产品。

另外，益生菌发酵乳在大健康产品中占有越来越重要的作用。我们说，在全球，每年因为营养不良而造成的 GDP 的损失，超过了 2008~2010 年金融危机期间的经济损失，可以说食品是非常重要的。

英国、日本和美国都分别发表了他们的计划——《食品营养健康发展计划》、《生物技术战略大纲》和《营养科技长期支持的计划路线图》。比如说，美国是加快人类营养学的研究进展，帮助和改善和维持所有儿童、成人健康和社区的健康。其实，我们中国也有“健康中国2030”的一个健康的计划。

在世界范围，我们说，肠道的科学推动发酵乳从营养到功能。那么什么是功能呢？我理解，就是长期食用某一种食物，对人类造成的一个健康的效果。

那么肠道微生物呢，是人类的第二基因组。过去我们一直认为，它主要是与消化吸收免疫调节有关。事实上，现在肠道菌群与糖尿病、肥胖，还有心血管疾病，也有很好的关联关系。

可以说，菌群的健康与人体的健康具有非常密切的关联关系，益生菌可以调节菌群的健康。

益生菌有两个重要的发展方向：第一个就是功能的细化，第二个是功效的专业化。

今天我们可以看到我们的展会当中，益生菌有消化健康、免疫、皮肤美容等等功能。

另外一个发展方向就是专业化。我们也注意到，我们越来越关注它的科学临床的研究，包括开展体外、动物和人体健康功能的研究。所以它会向功效和专业化方向发展。

那么益生菌和肠道微生物、和肠道之间、和人体健康有着非常密切的关系。

益生菌一方面通过定植粘附，另外它通过产生代谢产物，来影响人体的健康。那么，胞外多糖就是非常重要的一个代谢产物。

接下来我想向大家介绍一下胞外多糖（EPS）的结构和功能。就是作为一个重要的代谢产物，它有什么样的结构？还有什么样的功能？

胞外多糖是乳酸菌在代谢过程当中分泌到培养基中的一种多糖类的物质。有两种，第一个是荚膜多糖，还有一种是粘液多糖。

作为微生物的一个次级代谢产物，它有两个功能：一个功能是在我们食品当中有增稠、乳化、保湿和稳定的作用，可以改善我们发酵乳的质构；另一方面，它也具有生理功能，比如说抗肿瘤、免疫调节、降低胆固醇和调节血压等等。

那么我接下来，我想介绍一下我们光明乳业筛选的胞外多糖的产生菌株，以及它具有什么样的功能。

干酪乳杆菌 LC2W，我们在 2001 年进行了菌株分离，在 2005 年进行了专利的保藏，在 2010 年进行了全基因组的测序。

这里我们可以看到，它有三种胞外多糖，即 LCP1、LCP2 和 LCP3。

我们证实了第一个片段的 LCP1 具有重要的生理功能。我们对它进行了一些分离，它是由葡萄糖、鼠李糖和半乳糖来组成的。

这边是它的一个结构，那么它具体有什么功能呢？

第一个是调节肠道菌群的作用。将它与粪便菌群进行共培养，发现它可以增加人源粪便中双歧杆菌的丰度。

肠道菌群主要利用的是胞外多糖的大分子的组分。另外，菌体代谢产物，主要是短链脂肪酸，可以起到调节肠道的作用。

另外一个是调节免疫和缓解炎症的反应。这个胞外多糖组分对细胞是没有毒性的，对 T 和 B 淋巴细胞具有不同程度的刺激作用。另外，它可以刺激白细胞介素-10 的释放，释放量与胞外多糖的浓度呈正相关。

这个是我们 2015 年从保加利亚的一种传统的发酵乳当中分离的鼠李糖乳杆菌，它具有良好的产粘性能。从我们下面的图可以看出来，加入蔗糖以后，它产生的胞外多糖会更高，它的粘度也会更粘。

这是我们从西藏牦牛乳当中分离出一种牛类芽孢杆菌，我们称它为是下一代的益生菌。它的胞外多糖产生最高可以达到 36.25 克/升，是一个左旋的左聚糖。下面是它的分子的结构。

那么，作为一个益生菌来讲，它为什么会产生胞外多糖？我们这里介绍一个机制。

我们的机制是认为，乳酸菌在氧压力条件下会产生胞外多糖。因为益生菌多数是为兼性厌氧菌。接下来我们给大家分享这个内容。

就是说在氧存在的条件下，厌氧菌为了规避氧的刺激，它会产生絮凝体。絮凝体就是一种不溶性的胞外多糖，菌体会被不溶性的胞外多糖所包埋、所包裹，就隔绝了氧对它的伤害。这是益生菌对环境所做出一种适应，所以随着氧压力的增加，胞外多糖就显著地增加。

那么它有什么好处呢？因为它规避了氧气，我们可以看到生长曲线当中，加入蔗糖的一组产生了胞外多糖，与对照相比，在氧压力的条件下，它的活菌数会更高。所以说它就对菌体实现了一个自我的保护。

进一步我们对它的合成的酶进行了一些表达，发现胞外多糖的合成酶过量表达以后，可以促进胞外多糖的大量的生成。

那么它对其他的菌有什么好处呢？

它既然缓解了氧压力，我们就做了一个实验。就是产胞外多糖的明串珠菌跟植物乳杆菌，还有双歧杆菌厌氧菌在一起的时候，由于胞外多糖消耗了氧气，所以这两个菌就可以协同地生长。

这就是我们说协同发酵的一个理论的基础。

进一步我们可以看到，在培养基上，明串珠菌是产生胞外多糖，然后它临近的乳酸菌，对氧本来是敏感的。但是由于明串珠菌消耗了氧气，所以造成了一个相对厌氧的环境，在它附近就会有氧敏感菌株的生长。

进一步，我们做了一个实验。我们也可以看到，在协同发酵的时候，植物乳杆菌 ST3 的 log 值从 7.56 增加到 8.15。

那么作为一个菌体来讲，胞外多糖是哪些基因来控制？它的代谢途径是怎么样子的？所以我们又进行了胞外多糖的合成和调控、基因组的分析。

这个是它的全基因组的一个测序，基因组大小是 3.04Mb，G 加 C 的含量是 46.36%。右边这个图是它的合成胞外多糖的基因簇，这个是它合成的相关的基因。

我们主要考察了 6 个基因，包括它的基因产生的产物和它的一些相关的片段。第一个的话，比如说葡萄糖转移酶，它主要产生转移酶，这个途径是我们要分析的。

我们可以看到，乳酸菌经常是通过糖酵解途径来生成乳酸，但如果生了胞外多糖的时候，它要合成半乳糖，还有鼠李糖，所以我们分析它的基因来确定它是如何进行调节的，后面我们可以去证实。

它的限速步骤是 pfk 基因，还有 nox 基因是改变了它益生菌还原的状态。另外它增加了进行 Leloir 途径的生成，所以形成了胞外多糖的单元，从而形成胞外多糖。

我们首先对它的基因进行了克隆，主要是有 8 个基因。

那么我们对一个重组菌株进行研究以后，发现其实跟我们上面这些途径的分析是一致的，就是 nox 基因改变了它的还原状态，所以提高了胞外多糖的产生率。

重组菌株过表达氧化酶以后，提高了 EPS 的产量。

那么红色的就是我们重组菌株，我们可以看到生长得缓慢，但是它酶活率提高，减少了乳酸的产生，同样也增加了胞外多糖的产生。这就是益生菌在它自己的菌体条件下，它如何调节它的基因和它的表达来适应环境，来产生一些环境的应变。

那么，对重组菌株我们也进行了分析，可以看到它是对厌氧条件下和在好氧条件下的胞外多糖的合成量，是不太一样的。

那么进一步地，我们通过转录组的分析可以看到，胞外多糖的合成区组是显著上调，乳酸脱氢酶的基因是显著下调。

这个就是益生菌在面临氧的压力条件下，如何调整它的基因，通过它的合成，实现了胞外多糖的产生量的提高。

接下来我想讲一下，胞外多糖乳酸菌在产业上它有什么样的应用。

我们这个菌，现在是在乳酸菌饮料、益生菌粉和益生菌的发酵乳当中进行使用。

当然它还有一个特点，就是可以生产无添加的发酵乳。因为胞外多糖它在生产上，它可以减少乳清的析出，另外它和兼性厌氧的一些益生菌协同发酵，就可以生产无添加的发酵乳。

另外，我们也做了一些临床的试验。比如说我们清润高手的发酵乳，在北京朝阳医院进行了 136 名受试者的试验，发现它可以减少呼吸道的感染发生的次数和症状以及持续的天数。

接下来我想谈一谈益生菌的发展的趋势，我主要有三个方面的观点。

第一个，是开发自主知识产权的菌株。

这个可以说，在乳业的发达国家起步比较早，那么中国，今天也看到我们肠道大会上有很多公司也在不断地开发他们的益生菌菌株。

这里，一个是我们要加强自主产权菌株的开发，另外要建立面向中国人群的筛选标准。因为我们生长的环境不一样，基因不一样，肠道菌群也不一样，所以需要建立和评估我们自己的筛选的标准。

另外，我们鼓励我们的企业标示新的菌株的名字，我们需要形成科学的共识。

那么，促进行业的发展，我认为有几个方面的重要的步骤：形成一些指南类的文件和团体的标准，进一步形成法规完善的菌株筛选体系和评价标准。

第二个，是建立良好的生产的规范。

那么作为菌株来讲，活力不高、污染杂菌和稳定性差，是它作为益生菌的最主要的三个重要的技术难题。

因此，需要开发一些先进的加工工艺和设备，建立益生菌良好的生产规范和高品质的益生菌评价体系。

第三个，我想说，对于益生菌发酵乳而言，需要建立功能发酵的评价体系和菌的鉴定鉴定标准。

我们说现在的国家标准，它还难以满足发酵乳品多元化和功能化的需求，所以就要建立功能发酵乳的功效评价体系。

我们知道，现在对于乳酸菌、益生菌来讲，主要是测定它复合菌株的菌数，但是我们来以后是需要将开发一些新的方法能够鉴定出种、这个菌种或者（菌）株含量或者菌的数目，那么就需要一些新的方法。

作为企业来讲，需要研究一些新的检测方法，并形成行业标准来评价我们发酵乳。这样的话，通过这些手段，我们可以促进我们益生菌发酵乳健康和快速的发展。

最后，感谢我们光明乳业研究院的很多的同事，在这方面做了很多的工作。

感谢各位，谢谢大家！