单细胞时代|| 单细胞代谢组学之免疫代谢
男，
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生信技能树核心成员，单细胞天地特约撰稿人，简书创作者，单细胞数据科学家。
Immune metabolism in PD-1 blockade-based cancer immunotherapy Immunometabolism in the Single-Cell Era A novel strategy for single-cell metabolicanalysis highlights dynamic changes in immune subpopulations Spatial metabolomics of in situ, host-microbe interactions
这不是最好的时代，也不是最坏的时代，这里是单细胞时代。灵活的单细胞系统，高效的组织解离液，开源的数据分析工具，端到端的单细胞解决方案是未来发展的趋势。这里最主要的是开放灵活的单细胞系统，有了这个系统我们就可以自主地设计反应体系，来从不同纬度捕获单个细胞的信息。
我们知道，单细胞转录组数据分析的下游往往聚焦在pathway上，其中，代谢通路是大家关注比较多的。代谢也是联系转录组与表型的关键。单细胞代谢组学期望的是考察单个细胞的代谢水平。我们知道，活细胞无时不在与外界进行着物质和能量的交换，那么，其代谢水平应是其生命体征的主要表现。如果说单细胞转录组帮我们识别出细胞的身份，代谢组将反应细胞的即时状态。单细胞代谢组学至少在通量和空代（空间代谢组）两方面带给我们新的见解。今天，我们跟着Immunometabolism in the Single-Cell Era来看看单细胞代谢组的进展与希望。
目前研究已经确定对免疫细胞的适当调节，可以促使我们理解其代谢途径以及它们紊乱时如何导致免疫功能紊乱和疾病发展。然而由于技术上的限制，这种见解严重束缚于免疫细胞的体外激活，还是bulk水平的。但随着单细胞应用的出现，研究人员现在可以估计临床样本中单个免疫细胞的代谢状态。
在这里，我们回顾这些单细胞技术和他们验证免疫代谢的共同原则，同时也概述免疫细胞的代谢异质性。我们讨论当前技术的局限性以及未来的机会，以推动该领域发展，当然也希望该领域的发展能提高人类诊断和治疗疾病的能力。
新陈代谢是所有生物过程的核心，它可以被广泛地细分为合成代谢过程(使用能量和构建块进行生物合成)和分解代谢过程(为合成代谢提供原料，并产生能量为生物功能提供燃料)。除了这些功能，代谢酶和中间体有重要的调节作用，是主要的控制细胞行为的小分子。最近在免疫代谢领域的研究表明，在健康和疾病中，代谢程序和它们所支持的特定免疫功能之间有着密切的联系。这些核心代谢功能的失调与许多现代疾病有关，包括癌症和慢性炎症性代谢疾病，如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化和类风湿关节炎。然而，由于疾病的复杂性和所涉及的细胞表型甚多，对于发生在致病环境中的免疫代谢重塑的详细了解还很缺乏。
营养水平的改变/氧气可用性/信号因子的存在以及与邻近细胞的相互干扰，都会诱导代谢变化，使细胞在其特定的组织微环境中发挥作用。由于每个细胞都生活在一个独特的环境中，我们体内没有一个细胞在新陈代谢、表型和功能上完全相同。在单细胞分辨率下，解决免疫代谢的时空异质性和阐明这一复杂性将推动免疫代谢领域向前发展，允许转换到临床应用和理解体内免疫学的基础。
事实上，为了充分理解细胞代谢调节免疫和疾病进展的机制，研究人员需要能够解决免疫细胞代谢转化为效应表型的轨迹。可以说，单细胞图谱技术具有解决上述所有问题的能力，即使在目前的发展状态下也是如此。
从这个角度出发，我们将探讨当前和新兴的先进技术如何有助于我们理解免疫的代谢调节，并讨论从bulk到单细胞免疫代谢谱分析的转变。
常见的bulk代谢分析
细胞外通量分析 （Extracellular flux analyzers）
细胞外通量分析仪，如海马装置（Seahorse apparatus），实时记录细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)作为代谢的关键读数，并以此提供糖酵解和线粒体呼吸的间接测量。虽然使用特定的底物和抑制剂可以研究细胞对葡萄糖、谷氨酰胺或脂肪酸的相对偏好，但细胞外通量分析不能提供关于糖酵解和线粒体内TCA循环以外代谢途径活性的详细信息。事实上，这项技术允许简单、快速地以96孔的方式对细胞进行分析，这极大地扩展了免疫代谢的研究视野。
应用该技术的发现包括炎性巨噬细胞的糖酵解开关和线粒体功能障碍，效应T细胞和活化的树突状细胞(DCs)的糖酵解增加以及T记忆细胞和il -4活化的巨噬细胞的线粒体呼吸增高。值得注意的是，ECAR是糖酵解的替代标记，培养基酸化不一定是糖酵解增强的结果。实际上线粒体呼吸二氧化碳的产生或细胞外TCA循环中间体(如琥珀酸盐)的释放也会使培养基酸化。这一局限性可以通过对糖酵解途径进行靶向代谢组学或通量组学来克服。
稳态代谢组学
对于一个给定的时间点，代谢组学通过液相或气相色谱-质谱(LC-MS或GC-MS)测量一系列代谢物的稳态水平。非靶向代谢组学测量生物样本中的数百种代谢物，而靶向代谢组学则评估预先选择的代谢物，并产生具有更高灵敏度的数据，并允许对代谢物浓度进行精确的绝对定量。除了测量小的代谢物，高分辨率MS-based profiling最近被应用在“shotgun”脂质体学中，分析不同活化的巨噬细胞的脂质体。大多数基于ms的方法仍然需要相对高水平的输入通量(大约100,000s的细胞)，然而最近的发展提供了一种以单细胞分辨率空间测量代谢物的方法。关于空间和单细胞代谢组学领域的最新发展的更深入的信息，我们参考了对主要新兴方法的综述，包括基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱成像和二次离子质谱(SIMS)。将这种分析与本观点中讨论的单细胞方法相结合，必将有助于阐明在体内复杂组织微环境中单细胞水平的免疫代谢。
Fluxomics
通过给定途径的通量改变不一定与该途径内代谢组学测定的特定时间点的代谢产物水平直接相关。通过靶向质谱在连续时间点对底物和同位素同位素的测量，可以确定代谢通量和途径动力学。代谢组学提供了某一特定时刻代谢物的“快照”，而13C/15N的标签追踪(或所谓的Fluxomics )可以被视为一种“快照”。在单细胞分辨率方面，这种分析的使用仍处于起步阶段，但在bulk方法中，如在Kibbey开发的质量同位素多序数光谱分析(MIMOSA fluxomics)，群落可以很容易地用于量化特定代谢反应的速率实验室(Alves等，2015)。
关键的免疫代谢概念
单细胞代谢谱分析方法中针对不同代谢蛋白提供了最低限度的免疫代谢背景。关于免疫代谢的更多细节，我们参考了在不同的免疫细胞和疾病中关于这一主题的优秀和更全面的评论。
糖酵解解析多种免疫效应功能
免疫激活是一个需要能量的过程，通常伴随着糖酵解通量的增加。糖酵解开始于葡萄糖转运体摄取葡萄糖(例如，GLUT1(在免疫细胞中占主导地位)和随后在细胞质中加工产生丙酮酸，生成ATP，并在此过程中将NAD+还原为NADH）。Elegant的研究强调了糖酵解酶己糖激酶1和2 (HK1和HK2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶和丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)。为了在没有线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)的情况下维持糖酵解通量，细胞可以通过乳酸脱氢酶将丙酮酸还原为乳酸(LDH)回收NADH为NAD+。
在Seahorse 分析中，当质子和糖酵解衍生的乳酸通过单羧酸转运蛋白MCT1从细胞中输出时，这种发酵反应可以被称为ECAR。而糖酵解在炎症免疫效应细胞中最为显著(Krawczyk等，2010;(Michalek等，2011)，它对多种免疫激活模式至关重要，包括替代巨噬细胞激活和T调节性(Treg)细胞的诱导，而且糖酵解率在B淋巴细胞和T淋巴细胞之间存在差异。然而，在巨噬细胞促炎活化过程中，TCA周期通过下调IDH和SDH活性而被显著重构(Jha et al.， 2015)。后者是通过激活的髓细胞中ACOD1/IRG1特异性产生的免疫调节代谢物itaconate直接抑制而实现的。
脂肪酸代谢影响免疫细胞表型和功能
脂肪酸氧化(FAO)是一种分解代谢途径，将脂肪酸转化为乙酰辅酶a、NADH和FADH2等产物，用于线粒体产生能量。肉碱棕榈酰转移酶1和2 (CPT1和CPT2)将长链脂肪酸穿梭到线粒体基质中，随后通过羟酰基辅酶a氧化为乙酰辅酶a图1所示。免疫细胞亚型的关键代谢途径(A)是调节免疫细胞重要的代谢途径，包括最近单细胞分析方法中使用的代谢靶点。cpt1抑制剂依托莫西的浓度过高表明了这一点FAO在il -4诱导的巨噬细胞、记忆T细胞和treg中尤为重要。然而，最近对CPT1和CPT2使用细胞特异性基因敲除的文献报道，FAO在这些过程中很少。
与FAO相反，FAS是一种合成代谢途径，将胞质乙酰辅酶a转化为脂质。乙酰辅酶a羧化酶(ACC)首先将乙酰辅酶a羧化为丙二酰辅酶a，然后被脂肪酸合酶(FASN)拉长。FAS支持效应T细胞的增殖，是配置巨噬细胞炎症信号的质膜的关键，也是内质网合成使活化的DCs分泌细胞因子的关键。
不同的免疫细胞有着不同的氨基酸代谢途径
T细胞的免疫激活与氨基酸代谢需求的增加有关，例如l型氨基酸转运蛋白1 (LAT1、CD98和SLC7A5)的重要性以及TCR参与后成功信号转导的丝氨酸途径。此外，氨基酸在调节免疫反应的特定方向方面发挥作用。例如，两个Th1和Th17细胞通过转运蛋白ASCT2增加谷氨酰胺用量，以应对抗原受体的刺激，而抗炎treg不受谷氨酰胺供应改变的影响。谷氨酰胺酶(GLS)将谷氨酰胺转化为谷氨酸为TCA循环提供燃料，该途径促进Th17分化，同时降低Th1和细胞毒性T淋巴细胞分化。
在巨噬细胞中，氨基酸也发挥着重要的功能和调节作用。谷氨酰胺代谢与抗炎极化程序有关，丝氨酸代谢与IL-1b的产生调节有关。此外，氨基酸还可用于巨噬细胞产生效应分子。LPS(+IFNg)诱导的巨噬细胞主要通过诱导NO合成酶(iNOS)将精氨酸转化为一氧化氮(NO)，而il -4诱导的巨噬细胞主要将精氨酸代谢为鸟氨酸和多胺。要了解更多关于氨基酸如何调节免疫的信息，我们参考了最近关于这个主题的一篇优秀的综述(Kelly和Pearce, 2020)。
重要的是，迄今为止所描述的大多数概念都是从体外培养和激活的免疫细胞的bulk测量中得出的。如下所述，技术上的限制很大程度上阻碍了现行方法在体内的验证。接下来，我们描述了解决这些关键问题的单细胞方法，以推动免疫代谢领域到下一个水平。
当前方法的局限性
需要从体外到体内验证
鉴于环境因素的重要性，实验室细胞培养的免疫细胞代谢明显不同于体内细胞培养。事实上，Ma等人最近在小鼠中使用13c -葡萄糖输注的方法研究了CD8+ T细胞对李斯特菌感染的代谢，并观察到体内活化T细胞的代谢情况有根本不同。在vito激活的T细胞中，CD8+ T细胞从OXPHOS向糖酵解转变，而在体内激活的CD8+ T细胞显示更高的氧化代谢率和依赖葡萄糖依赖性丝氨酸的生物合成。这项工作中开发的方法需要精细的实验操作，而且不容易扩展或适用于人类样本。由于动物模型有其自身的局限性，而且并不总是能够复制人类免疫学和生物学特征，因此这种在人体环境中的转换是很重要的。
一般来说，利用这些和其他技术进一步发展体内(或体外)细胞代谢评估在该领域具有先导作用。同时，体内免疫代谢研究的关键概念的验证，特别是在人体内需要代谢谱的替代选择。
免疫代谢的时空特征
免疫细胞非常依赖营养物质的及时供应，而营养物质的及时供应取决于细胞在肿瘤或炎症部位微环境中的位置。分类和bulk测量不可避免地抹平了细胞种群的分布差异，这掩盖了时间和环境的影响。因此，了解细胞在单细胞分辨率下的代谢状态，可以解释其在体内复杂组织微环境中表型异质性的分子机制。这可能有助于理解它们功能背后的原因，或者它们在病理环境下无法正常工作的原因。大多数最新的转录和成像技术可以解决单个细胞甚至代谢物的空间排列问题，它们的进一步发展将对进一步理解人类样本和体内环境中的免疫代谢重构至关重要。
时间是免疫代谢领域经常被忽视的另一个方面。我们知道，大多数免疫细胞在激活后糖酵解迅速增加，这最终导致代谢通量增加，并在其效应状态下大量特定代谢物(通常在24小时后)。然而，这是如何随着时间的推移发生的，它是如何支持效应表型的获得和疾病的发展的？这些问题都还没有具体的答案。解决免疫细胞通过代谢转化为效应表型的动力学问题，对于确定哪些事件是原因，哪些事件是果至关重要。总之，理解免疫代谢的时空异质性不仅将彻底改变我们的基础生物学知识，而且也有助于合理设计新的治疗方法。
通量的限制
免疫代谢研究中，常用分析技术（bulk）的局限性至少可以部分地解释我们面临的在体外到体内的转化和从老鼠到人的验证的困难。代谢组学和细胞外通量分析的一个主要警告是需要相对高的细胞数量，而这在人类临床样本中通常不存在。例如，Seahorse XF分析仪测量每孔中数万到数十万个细胞的细胞外通量，通常需要4-5个复制孔。对于代谢组学，研究人员通常测量每个复制的50万个混合细胞，即使有这么高的输入，代谢的覆盖范围也是有限的，因为我们通常测量细胞中估计存在的数千个代谢物中的几百个。细胞外通量分析和传统代谢组学的另一个缺点是，它们评估的代谢特征不是很稳定。因此，获得的结果可以受到长时间和苛刻的组织消化和荧光激活的细胞分选仪的影响。因此，需要新的代谢谱分析方法以及新的、优化的细胞分离方法来测量体外少量免疫细胞的稳定代谢特征。
间接评估细胞代谢水平
代谢组学与其他“在处理过程中更稳定的组学数据(如转录组学和蛋白质组学)”相结合，至少可以部分克服代谢物水平的不稳定性。代谢通量可以看作是代谢物水平和代谢它们的酶的存在和活性的结果。基因表达分析和蛋白质组学已经可以为代谢途径的调控提供一些见解，但当与代谢组学数据整合时，就变得特别强大。利用网络整合的方法，Jha等人确定了TCA周期中支持炎症巨噬细胞反应的一个重要代谢停滞。Baardman等人也结合代谢组学和转录组学数据证明含脂巨噬细胞中，PPP与炎症反应的降低有关。同样，蛋白组学和代谢组学的整合揭示了T细胞活化的代谢需求。这些独特的“组学”方法，特别是当整合时，可以揭示调节代谢枢纽，可以使用基因工具或药理学化合物进行功能分析。
目前单细胞代谢组学的大规模应用还为时过早，因此免疫代谢研究进入单细胞时代需要替代方法。先前使用bulk转录组学和蛋白质组学描述细胞代谢的成功表明，使用相关的单细胞组学方法是目前的发展方向。为此，最新的单细胞RNA测序(scRNA-seq)和基于细胞的方法在单细胞分辨率绘制代谢景观将在本文的下一部分讨论。
基于单细胞转录组分析细胞代谢
随着scRNA-seq的出现，人们可以在复杂的多细胞生态系统中解析单个细胞的转录谱，这在免疫学中是非常重要的。如今使用 10x Genomics，scRNA-seq实验每样本多达1万个细胞，常规检测每个细胞2到4千个基因。即使在免疫学背景下直接检查scRNA-seq数据，也可以很好地说明发生在体内的关键代谢过程。例如，我们可以使用免疫检查点封锁抗体(ICB)、抗pd -1/抗ctla -4抗体或对照抗体。在本系统中，ICB治疗导致肿瘤排斥反应，与免疫室的整体激活和髓系室内活化细胞的出现。如图2A和2B所示，我们创建了这个scRNA-seq数据集的可视化信息，以演示免疫细胞亚群中一些关键代谢基因的行为，值得注意的是:
与糖酵解活性增加相关的基因像Glut1在ICB处理后的活化巨噬细胞中富集。 Nos2是炎症巨噬细胞活化的代谢基因，在ICB治疗条件下特异性的巨噬细胞中富集。 Phgdh的表达与Mki67高增殖T细胞的表达相关，这与描述丝氨酸代谢在T细胞增殖中的作用的体内外bulk分析一致。 NRF2转录本(Nfe2l2)是氧化应激反应的关键因素，相对于T细胞，巨噬细胞中NRF2转录本(Nfe2l2)的水平通常富集，且似乎不依赖于治疗条件。然而，其直接靶点如Hmox1在炎性巨噬细胞亚群中确实增加，这与NO和itaconate潜在的氧化/亲电应激相一致。总之，这与NRF2主要在蛋白水平上受到调控的事实一致(Taguchi等人，2011)，并强调了对这一关键的代谢调节因子，需要分析蛋白而不是基因表达。
直接检测scRNA-seq数据中特定关键代谢基因的类似方法被证明在描述果蝇眼睛发育过程中细胞凋亡的代谢方面是有效的。总之，这些例子说明了在研究新陈代谢方面scRNA-seq数据的潜在用途。然而，在单细胞分辨率下全面绘制代谢全景的方法仍然相对缺乏，并且/或处于发展的早期阶段。大多数对scRNA-seq数据进行代谢分析的方法来自bulk RNAseq分析技术，在进行这一转变时必须克服相当大的挑战。
事实上，bulk的转录分析提供了一个吸引人的数据，因为它产生关于转录水平在序列细胞内的详尽信息。因此，没有信号通常意味着没有相应的转录。这与代谢组学分析相反，在代谢组学分析中，由于技术限制，而不是由于代谢物本身的缺乏，覆盖范围有限，信号缺失经常出现。然而，这种转录谱分析的优势在scRNA-seq数据中并不明显。由于通常较低的测序深度和drop-out事件，个别基因在某些细胞中的表达水平可能出现零，即使这些基因实际上是表达的。典型的测序深度是每个细胞25000 - 50000个reads，这样每个细胞就能准确地检测到3000 - 4000个基因。浅测序(即每个细胞1000个基因的顺序)可能会检测到大多数常见基因和家养基因，而只有很少的亚种群特异性基因，这将导致在将数据与其他已发表的签名进行比较时出现重大困难。然而，即使每个细胞检测到3000 - 4000个基因，也远远低于估计的12000 。根据bulk RNA-seq数据，15000个基因在纯化细胞群中表达。在这些情况下，技术，如数据估计必须用于后处理数据和获得平滑的转录概况。例如，与T细胞或巨噬细胞相比，中性粒细胞中通常检测到较少的总转录本。因此，在比较不同细胞间的途径时需要谨慎，因为某些簇的覆盖率较低可能导致假阴性结果。大多数用于scRNA-seq数据的代谢分析方法可以大致分为两大类，简要描述如下:
(1)基于通路富集的分析 (2)基于通量平衡分析(Flux Balance Analysis，FBA)的方法。
基于通路富集的分析
构成不同代谢途径的基因被很好地注释(Kanehisa和Goto, 2000)，并且可以使用标准的生物信息学途径富集技术直接对基因集进行研究。这种简单而强大的方法可以揭示新的生物学洞见。例如，根据对已发表的大量RNA-seq数据中该通路转录富集的初步观察，研究了T细胞中丝氨酸代谢的作用。如图2所示，在scRNA-seq数据中，该通路在增殖的T细胞簇中富集。最近，Xiao等人展示了如何调整途径富集管道进行scRNA-seq数据分析，并利用其表征肿瘤微环境内的代谢多样性。使用类似的分析策略，Miragaia等人(2019)强调了在不同组织中treg的代谢异质。
Flux Balance Analysis-Based Approaches
FBA是一种计算系统中代谢通量稳态分布的方法，该系统将满足给定网络结构的输入和输出通量的约束。简单地说，FBA将细胞内的代谢布线视为一个输入输出水龙头数量有限的管道系统，要求系统的每个节点都建立稳态平衡。换句话说，进入每个反应的代谢流量应该等于离开那个反应的代谢流量。因此，单个酶的特异性表达水平并不直接参与建模，透视图的结果主要依赖于网络拓扑结构和模型的输入和输出。输入通常是最常见的底物摄取反应(例如，葡萄糖，谷氨酰胺)，输出(通常称为目标函数)与被研究的特定细胞行为相关。例如，一个目标可以是最大限度的生产生物量生长细胞或生产某些代谢物，如 活化巨噬细胞的NO。
基于FBA的方法的一个重要优势是，它们依赖于网络分析，而不与预先定义的通路知识相关联，因此可以揭示新的生物学概念。因此，它提供了一个强大的工具，以了解随着网络拓扑结构的变化而发生的代谢通量变化，例如，由于基因敲除或组织特异性表达模式。事实上，Zhang等人已经演示了使用FBA-base方法对不同组织中的NAD+生物合成进行基于scrna -seq的分析。从概念上讲，这项工作遵循了基于来自不同组织的bulk RNA-seq数据研究组织特异性代谢的方法。除了观察明显不同的网络拓扑，FBA框架允许研究在相同网络内的代谢重塑，但在刺激诱导所需细胞输出量变化的基础上。这是可行的，当至少一些关键的代谢特征是已知的时候。此前，大量数据采用这种方法揭示了itaconate作为SDH抑制剂的作用(Lampropoulou等，2016)。最近，该方法被引入到scRNA-seq数据中，以研究致病性/非致病性Th17细胞的代谢差异，以及与Tregs的差异。
需要注意的是，当前方法通常关注两种不同细胞群之间的差异。在这些情况下，更直接的方法是简单地执行两个种群之间的差异表达分析，并执行通路富集分析或代谢子网络分析。我们认为，这是至关重要的，过去的一对一比较已知细胞类型，并学习捕获整个数据集内的代谢多样性。因此，下一代代谢scRNAseq分析方法有望揭示独立于细胞身份分配的主要代谢变异。虽然目前在所有代谢基因的空间中简单地进行这种聚类或使用注释的代谢途径作为主要成分是可行的，但最强大的聚类方法将在没有单个途径先验知识的情况下结合基于网络的分析依然是困难的。这将允许将单个细胞作为不同的代谢实体，并将从新陈代谢的角度提供对整个细胞生态系统的不偏不倚的观点。
基于蛋白质的单细胞代谢分析
利用Mass - Cytometry分析单细胞代谢
单个细胞内蛋白质仍处在起步阶段(Slavov, 2020)，尚未应用于immunometabolism研究,最近的文献展示了使用大规模血细胞计数(cytometry by time of flight,CyTOF)估计单个细胞内酶的代谢。这种技术允许同时量化1- 40个参数在单细胞分辨率下。在免疫代谢的背景下，应该考虑包括针对主要代谢的抗体。不出意料，由三个不同的研究小组独立设计的代谢小组显示出相当大的重复。
为了设计免疫代谢细胞panel，Hartmann等首先筛选了超过100个商业抗体针对广泛的代谢因素，并选择了41个代谢抗体，通过所有生物控制，并在人类白细胞的概念验证研究中产生了稳健的可重复的结果。根据谱系标记表达模式识别出不同的免疫细胞亚群后，无需预先分类就可以估计和比较所有免疫细胞亚群的代谢状态。通过mass cytometry获得的代谢状态图谱与它们在特异性免疫功能中所描述的角色一致，例如浆细胞样dc中与葡萄糖和脂肪酸代谢相关的靶点高表达，以及中性粒细胞中高水平的限制率的PPP酶G6PD。此外，哈特曼等人已经证明了海马测量的T细胞代谢变化与单细胞蛋白水平上观察到的变化之间高度一致。这强调了基于细胞的单细胞代谢谱是一个强大的工具。
CyTOF在临床中的应用（代谢方向）
Hartmann等人(2020)通过比较结直肠癌患者的肿瘤和健康邻近组织，以及健康供体外周血单核细胞和淋巴结，发现了富含肿瘤相关CD8+ T细胞的特定代谢表型。这些细胞表现出大的中性氨基酸转运蛋白1 (LAT1，CD98)和多种酶在不同代谢途径上的表达降低。这些所谓的metalow细胞表现出明显的T细胞衰竭迹象，包括PD1和CD39表达增加，线粒体容量减少，TCF1水平低。值得注意的是，一小部分metalow亚群不表达PD1或CD39，这表明结合代谢和免疫细胞标记提供了额外的维度，在表型和功能上定义与人类疾病相关的肿瘤相关免疫细胞。
使用基于细胞的代谢谱的动物模型研究
除了人体样本，代谢细胞板也可以用于解剖动物体内的代谢重塑。Levine等人利用单核增生李斯特菌感染期间T细胞反应的基于细胞的代谢谱作为CD8 T细胞分化的良好模型。这里主要是基于早期的bulk代谢和之前的文献，因此，获得的mass cytometry数据很好地概括了该领域的概念。事实上，效应T细胞显示了预期的糖酵解活性的增加(Michalek) CyTOF分析中GLUT1和GAPDH的诱导也证明了这一点，海马分析中增加的ECAR同样证实了这一点。相反，记忆T细胞表现出CPT1a的诱导，CPT1a在FAO中起关键作用，之前认为与CD8记忆T细胞相关。这种代谢重组是以一种循序渐进的方式发生的，可以在单细胞分辨率下随时间推移而进行。这种代谢变化包括激活后早期的均匀糖酵解转换，激活2天后GAPDH的异质表达。这两个GAPDH群体表现出功能上的差异，这在bulk的方法中是无法发现的。
此外，该方法还发现了一个过渡的效应T细胞池，仅使用针对谱系标记和T细胞亚群的普通抗体无法检测到。这个新发现的亚群在感染后4天出现，具有高度增殖能力，糖酵解和线粒体氧化标记物均被强烈诱导表达，并分别受到CTP1a和CD98表达的脂肪酸和氨基酸的刺激。通过CyTOF检测到这一未知的过渡细胞子集后，作者接下来将这些细胞分类为CD62Llo CD44hi CD25hi，通过胞外通量分析证实其糖酵解和氧化代谢的增加。这是一个很好的例子，说明单细胞技术如何提供新的见解以及如何利用已建立的bilk分析来验证这些新发现。
Met-Flow:通过Flow进行单细胞代谢分析
使用荧光标记的抗体代替重金属偶联抗体，“常规”流式细胞术也可以进行单细胞代谢分析(有一些优点和缺点;见后)。基于流式细胞术的方法称为Met-Flow，使用10个氟铬偶联抗体靶向不同代谢途径中的限速酶和关键蛋白，结合表型标记生成27色流式细胞术面panel，以查询免疫细胞的代谢状态。作者使用了BD公司的X30 FACSymphony流式细胞仪。利用10个代谢标记的表达谱，Ahl等人可以聚类和分离血液白细胞亚群到不同的代谢。类似于Hartmann等人的CyTOF分析，CD4+和CD8+T细胞亚群不能单独在代谢蛋白上分离，但大多数其他免疫细胞亚群都能非常有效地单独基于它们的代谢概况来定义。这表明，使用与特异性免疫效应功能相结合的关键代谢酶抗体来扩展传统的流式细胞仪面板可能更有益，而不是染色额外的免疫细胞表面标记，因为其实际功能通常未知。即使使用相对较小的细胞检测面板，包括一些代谢性抗体，进一步解剖免疫细胞的表型、功能和代谢，使用几乎在每个研究所都存在的设备，也可能是非常有用的。这也支持了波兹南斯基和阿什卡尔的观点，他们之前提出的问题:
If an NK Cell Cannot be Defined by How It Looks, Could It be Defined by How It Is Fueled
独特的代谢指纹，而不是表型，表征NK细胞的功能命运：
值得注意的是，Met-Flow仅用10种代谢蛋白鉴定了血液白细胞亚群，其分辨率与500个基因的scRNA-seq分析相当，而单独分析相同的10个基因的表达不能区分免疫人群的差异。此外，Met-Flow证实了在T细胞激活时糖酵解、OXPHOS和FAS的上调，并且这种代谢重组被大量细胞外通量分析证实。后续的单细胞Met-Flow分析表明，大多数细胞依赖葡萄糖来进行代谢转换，但也发现有一部分CD4中央记忆细胞使用替代代谢途径。因此，单细胞(而bulk)的代谢谱能够识别单个T细胞亚群的特定代谢特征和需求。
单细胞代谢组技术的优点和缺点
单细胞转录组与Cytometry
单细胞转录组学和多颜色细胞计数术在获取信息和建立分析所需的实验装置方面是互补的方法。因此，它们可以同时用于获得最大的分辨率，但同时，任何一种方法都可以更容易获得或提供更多信息。在这里，我们描述了选择最优方法的一些基本考虑事项。
单细胞转录组通常每个细胞捕获3000-5000个基因。这允许无偏见的聚类数据和潜在的识别新的亚种群。从新陈代谢的角度来看，它允许跨许多途径同时检测多个基因，因此产生新陈代谢变化的全局图。另一方面，cytometry 一次只能做0-40个蛋白，因此，利用流式细胞术方法设计抗体panel需要合理的设计。
与此同时，两种方法所描绘的典型细胞数量是非常不同的，因为目前scRNA-seq每个样本只能处理约10,000个细胞，而流式细胞术可以常规处理数百万个细胞，如果需要，可以随时扩大规模。当需要考虑先天淋巴样细胞或树突状细胞等少数细胞群时，这种区别就变得至关重要。此外，单细胞转录分析的成本几乎是一个数量级的流式细胞术运行，因此，它是不可行的分析大量的复制或增加统计能力的分析，从相同的样本。此外，与流式细胞术相比，scRNA-seq对细胞形态更敏感。由于细胞形状和仪器设计的不兼容性，许多细胞类型，如肌细胞或神经元，不能被可靠地描绘。在其他情况下，如中性粒细胞，转录谱是复杂的脆弱的细胞和整体较低的RNA含量的细胞，这引入了显著的偏差。
另一方面，转录谱的一个显著优势是基于利用单核RNA-seq。在这种方法中，我们可以分离单个细胞核并描绘相应的转录。这种方法有几个重要的优点，尽管由于大多数RNA定位于细胞质而不是细胞核，检测到的转录本数量通常要少得多。首先，这种方法避免了形态学影响。但最重要的是，这种方法允许对冷冻样本进行定性分析，包括那些多年前已经进行过生物标记的样本。这开启了从临床样本中研究组织群的能力，而这些临床样本通常需要长时间收集。
尽管有这些优势，转录数据只提供了代谢测量的“两次移除”模式，在这方面，细胞检测是一个更直接的方法，产生蛋白质水平的测量。基于抗体的方法直接测量酶的水平，包括它们的翻译后修饰(及其关键调节因子的修饰)。使用基于细胞的方法的另一个好处是，它允许包含非基于蛋白的细胞表型标记。例如，通过包括标记的IdU、BrU和嘌呤霉素底物，代谢谱和细胞表型可以功能性地连接到合成代谢过程，如DNA、RNA和蛋白质合成。
总之，在受控实验设计的背景下，我们将提倡一种组合方法，其中scRNA-seq在有限的规模上运行以探索变化的广阔前景，然后使用假设驱动的抗体panle进行大规模的细胞分析以在蛋白水平上进行验证。
Cytometry 与流式细胞术比较
流式细胞术仍是最常用的免疫细胞图谱分析方法，但由于荧光技术的存在，可同时检测的参数数量相对有限溢出。当一种氟铬的荧光发射被另一种氟铬的探测器探测到时，就会发生这种情况。因此，流式细胞仪数据需要仔细补偿，这对大的面板尤其具有挑战性。然而，在流式细胞术中使用的颜色和抗体的数量正在快速增长，20个或更多的标记板现在很常见。与荧光检测器不同的是，CyTOF使用mass cytometer来检测每一种金属的TOF，而TOF是由其质量决定的(Spitzer和Nolan, 2016)。因此，检测重叠和背景(流式细胞术中的自体荧光)在细胞分析中都很低，因为重金属不会自然地出现在细胞中。设计理想的面板细胞仍然是减少由于金属标签的杂质造成的“溢出”，并考虑不同金属信号强度的差异的关键。此外，在流式细胞术中，细胞中没有质量通道与PE等亮荧光色一样敏感。
流式细胞术需要快速获取染色细胞以防止光漂白，而金属标记的样本可以(cryo)保存数周，并在临床试验过程中，当所有样本随时间采集时同时获得。或者，细胞可以被分离、固定、储存一段时间，并在临床试验或实验完成后一起处理。事实上，可以对多达20个样品进行独特的条形码编码，使我们能够将它们组合起来，然后染色、处理，并作为一个多路复用的样品获得它们。这些优势带来了成本，因为CyTOF抗体比荧光偶联抗体更昂贵，而且用于获取标记细胞的仪器在大规模细胞术中更昂贵和先进。虽然多色流式细胞仪几乎是每个实验室的主要设备，但大规模流式细胞仪却不那么常见，而且仅限于高端核心设备。
如今，光谱分析仪正在推动流式细胞术的发展。使用5个激光器探测64个通道的全部发射光谱，像Cytek aurora这样的仪器现在能够以一种灵敏、快速和可接受的方式探测30多种颜色。这对于(免疫)代谢研究特别有价值，因为它可以将针对代谢蛋白和mune谱系标记的氟铬标记抗体与荧光代谢工具结合，以提供额外的代谢信息。例如，葡萄糖转运体glut1的表达可以直接与荧光标记2NBDG的摄取相关。类似地，提示线粒体氧化增加的蛋白表达增加可以直接与线粒体质量和膜电位相关(见表2)。该技术的优点和缺点强力流汗细胞外通量分析(间接)功能reads细胞数目和复制需要仪器的可用性限制糖酵解和线粒体呼吸负担得起和快速受到细胞分离和分类代谢组学的影响。因此，基于荧光的流式细胞术的一个明显优势是荧光代谢染料的适用性，而大规模细胞术的最大优势是细胞板的大小、信号的稳定性和条形码的可能性，允许在临床试验中获得免疫细胞住院活检的深入的单细胞代谢分析。
免疫代谢的空间解决方案
目前列出的所有方法的一个主要缺点是它们需要悬浮的细胞，因此缺乏空间信息。空间方面是特别重要的，因为特定的微环境因素，包括复杂的混合刺激，营养物质的可用性和与邻近细胞的相互作用，是关键的驱动细胞代谢概况在组织和决定性的形状免疫和疾病进展。传统的单细胞分析方法的另一个缺点是，用于将组织分解成单细胞的特定协议会导致一些细胞死亡，但不是所有细胞，并且可能有利于与相关代谢分离特定的免疫细胞亚群。
综上所述，这些局限性强调了将细胞在组织微环境中的免疫代谢特征的关键观察值进行验证的必要性，并考虑到细胞的空间组织，避免细胞分选相关的问题。即时捕获空间环境和单细胞转录组谱的新方法正在被应用，但它们在免疫代谢研究中的应用还没有被描述。然而，最近的出版物强调了如何在蛋白质水平上以一种高度复杂的方式评估单细胞在其微环境中的代谢构型。
MIBI-TOF作为基于蛋白质的空间单细胞免疫/代谢分析
Hartmann等人通过将他们建立的代谢细胞面板转移到多路复用离子束成像(MIBI-TOF)平台，在空间代谢分析方面迈出了重要一步。这种最近发展起来的方法将单细胞代谢谱、免疫细胞表型和功能状态与细胞间的相互作用和组织内的位置结合起来。为此，组织切片用重金属偶联抗体(也用于Cy-TOF)染色，然后用离子束扫描，从识别特定代谢和免疫靶点的抗体中释放重金属。对于每个获得的像素点，释放的离子通过TOF-MS进行量化，就像在CyTOF中一样，重要的优点是mibi - tof获得的高维数据也包含空间信息。
染色结直肠癌和控制组织部分细胞系标记结合广泛的代谢抗体，紧随其后的是单个细胞的分割取得图像和随后的细胞到细胞系亚群。代谢概况空间组织在具有相似代谢特征的环境中，而与细胞类型无关。细胞表达与糖酵解、线粒体呼吸或氨基酸代谢相关的高水平代谢因子，经常被表达相同代谢目标的邻近细胞所包围。这种微环境驱动的代谢极化在比较靠近肿瘤边界的细胞和远离边界的细胞的免疫代谢谱时尤为明显。典型的是，代谢抑制细胞离肿瘤边缘较远，而代谢活性细胞则位于肿瘤免疫边缘。由于mibi - tof方法可以对从生物银行获得的现有FFPE材料进行，它提供了将免疫代谢特征和位置与临床结果和标志治疗成功联系起来的机会。因此，单细胞代谢谱是将免疫代谢研究转化为病房临床诊断和治疗的重要一步。然而，应该指出的是，特定酶的存在并不总是与其活性相关的，当从这些基于抗体的研究中得出结论时，应该考虑到这一点。
利用脱氢酶活性测定在微环境中绘制代谢图谱
Miller等人先前配置了一种替代方法来评估细胞在其组织微环境中的代谢配置。他们的方法依赖于饱和底物和辅助因子利用率的酶活性测量，并结合连续组织切片的多种免疫细胞马克森染色。测定了催化主要元bolic途径的五种酶的脱氢酶活性:PPP中的G6PD，糖酵解中的GAPDH，乳酸不乳酸发酵中的LDH，以及TCA循环中的IDH和SDH。当这些脱氢酶被激活时，硝基蓝四唑氯(NBT)被NAD(P)H还原为一种强烈的彩色状态，这种状态可以被量化，并与连续切片上获得的免疫细胞标记表达相关。作者利用这一技术研究了人类癌性和对照性结肠中巨噬体和T细胞亚群的代谢特征。与TME内的非炎性巨噬细胞相比，肿瘤内产生IL-6和TNF的巨噬细胞显示糖酵解GADPH活性增加，但与健康组织中的巨噬细胞相比，总体肿瘤相关巨噬细胞出现代谢抑制。因此，人们很容易推测，巨噬菌在肿瘤中的代谢适应能力受损可能会阻止它们的抗肿瘤活性。此外，在健康组织中，与Tregs相比，Tregs表现出癌症特异性代谢特征，糖酵解GAPDH活性受到抑制，线粒体SDH升高。识别免疫细胞亚群的这种肿瘤特异性代谢特性可以帮助开发新的治疗方法。值得注意的是，这些不同脱氢酶的活性是在饱和底物浓度下测量的，因此是对最佳脱氢酶活性的估计，而不是在特定环境下(如细胞竞争营养物质的缺氧环境)对其活性的精确反映。
结论与未来方向
很明显，理解单细胞水平上的免疫代谢的技术转变是不可避免的，尽管还没有完成。在单细胞分辨率下的转录组和蛋白质组分析显示了建立当前免疫代谢领域前沿的成熟水平，即对临床样本和炎症反应中的代谢景观进行初始评估和集中探测。如上所述，特定的代谢特征可以通过scRNA-seq分析或混合细胞培养/体外活体扩增的体积观察得知，然后通过专门的蛋白质靶向板进行解剖。例如，基于最近于面板之间的重叠，可以用代谢panle组成的10代谢抗体，也适用于多色流式细胞术和一组更大的panle包括一个额外的10个抗体。
尽管诸如CyTOF和scRNA-seq等方法对于不同细胞亚群内的代谢重构具有重要意义，但这些方法获得的原始数据仍然是间接的或有限的。因此，能够解决这些挑战的技术进步将为下一代免疫代谢研究奠定基础。两个关键的方向是:
(1)提高单细胞数据的深度和质量 (2)提高我们解决代谢特征空间分布的能力(例如，在组织切片内)。
下一代方法将包括直接单细胞代谢物分析(Duncan et al.， 2019)，这将伴随着稳健方法的发展，以分离单个细胞，而不受显著的代谢干扰(图3)。这种方法不仅可以直接评估代谢物水平，而且还可以在单细胞水平上提供通量组学，当细胞混合物，甚至动物和人，被标记的底物支持时。考虑到代谢物的不稳定性以及细胞分离会影响读数的事实，单细胞代谢组学的未来很可能不是在悬浮分离细胞中测量代谢物，而是在基于ms的成像方法中在其组织微环境中空间解决单细胞的代谢配置。要了解诸如用于单细胞甚至亚细胞分析的MALDI-MS等新兴技术的详细信息，我们请读者参阅最近的优秀评论。
以单细胞分辨率解决免疫代谢当然不是终末阶段，因为细胞不均匀，而是高度分区的结构，具有不同功能的代谢物在不同亚细胞位置的异质分布。例如，乙酰辅酶a促进线粒体内的三羧酸循环，同时促进细胞核内细胞质和组蛋白乙酰化中的脂肪酸和胆固醇生物合成。因此，改善代谢读数的亚细胞表达将为免疫代谢领域和遗传学领域的科学提供额外的一层视野。
在互补组学分析的背景下，沿着CITE-seq方法实现的路线进行的蛋白融合和转录组水平测量在免疫自代谢领域具有重大前景。特别的是，扩展基于cite序列的方法，用于细胞内蛋白质的粗犷测量，将允许测量大量的酶和它们的转运后修饰，因为抗体与核酸条形码结合，因此100-200个蛋白质可以同时测量。这将大大提高分辨率比目前0-40 抗体可能带有CyTOF，尤其是考虑到几乎一半的面板都是典型的细胞类型特异性标记。
此外，采用新的数据生成技术将需要开发一系列新的计算应用程序，这些应用程序可以将基于网络的数据与相应的技术输出集成在空间分配或免疫反应的潜在时间方面。利用诸如SCORPIUS这样的计算算法，有希望推断出伪时间序列，以研究代谢重组的假定时间序列。理解表型、功能和代谢变化的动力学可以揭示哪些代谢事件是因果关系，哪些只是特定免疫状态的旁观者。理解代谢的时空方面可以帮助合理地设计新的治疗方法，因为人们将有一个更好的理解疾病的驱动因素和旁观者效应。特别是，靶向代谢变化，这些变化在运动前可能也调表型改变，在免疫细胞可以改善免疫细胞功能和疾病的结果。此外，生理免疫反应发生在空间上高度组织化的多分子环境中。
我们设想，理解多细胞免疫代谢重构的基本原理，将为从关键的细胞内通路的干扰演绎过渡到成功的全身范围的异常反应通路。但很明显，我们需要额外的分析工具来全面掌握免疫代谢的时空信息，以及在单细胞水平上进行代谢聚类等任务。
总之，免疫代谢正在迅速成为一个系统水平的科学，其中需要多学科专家充分利用新技术。因此，为了成功地过渡到单细胞免疫代谢时代，计算技术的进步不仅在数据分析本身方面，而且在实验免疫学家的可用性和可交互性方面都很重要。