单细胞测序揭露小细胞肺癌化疗后瘤内异质性
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● 题目:Single-cell analyses reveal increased intratumoral heterogeneity after the onset of therapy resistance in small-cell lung cancer
● 发表日期:2020年2月17日
● 杂志:Nature Cancer
● DOI:https:/ / doi.org/10.1038/ s43018-019-0020-z
摘 要
小细胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)常常表现为化疗敏感到化疗耐药的快速演变,由于复发后组织样本的稀缺,这种转变的机制仍然不清楚。作者从 SCLC患者体内分离出循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell ,CTC),以此构建CDX模型 (CTC-derived xenograft, CDX),然后通过对患者CTC,以及化疗耐药和化疗敏感患者CDX模型进行单细胞测序,以阐释SCLC瘤内异质性( intratumoral heterogeneity, ITH)。从中,其发现化疗耐药的细胞群体ITH普遍性增加,包括治疗靶点和潜在耐药途径的异质性表达。同样,直接从血液中提取患者CTC进行分析证实复发后ITH增加。这些发现表明,SCLC耐药的特点是细胞亚群之间的基因异质性的表达,导致肿瘤出现多重并发的耐药。这些发现强调了临床上需要对初发的SCLC进行合理的联合治疗,以最大限度地提高初始治疗效果,抑制ITH及多重耐药的出现。
样本处理
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样本选择
化疗敏感性
MDA-SC39, MDA-SC68 , HCI-008, MDA-SC4化疗敏感;
MDA-SC16,MDA-SC49,MDA-SC55,MDA-SC75化疗不敏感。
一共构建了8个CDX模型
其中MDA-SC4、MDA-SC68 又构建了CDX耐药模型
单细胞测序取样点CDX传代次数:
MDA-SC4s: P3; MDA-SC16r: P3; MDA-SC39s: P2; MDA-SC49r: P2;
MDA-SC55r: P1; MDA-SC68s: P2; MDA-SC75r: P1; HCI-008: P3.
患者CTC取样:
MDA-SC55三个时间点: diagnosis, responding, relapsed;
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流程图
所有单细胞及bulk样本数据储存在GSE138474中
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数据产生及初步处理
10x 测序平台v2试剂盒,HiSeq 4000 (Illumina)测序
过滤、总细胞数量:CDX模型 Cells with fewer than 3,000 expressed genes and genes expressed in <10% cells were filtered out. The total numbers of cells in each model after filtering were as follows: MDA-SC4s: 8,998; MDA-SC16r: 7,173; MDA-SC39s: 2,053; MDA-SC49r: 2,593; MDA-SC55r: 2,853; MDA-SC68s: 2,779; MDA-SC75r: 3,959; HCI-008: 5,233. Each CDX model was downsampled to 2,000 for inter-model comparison. 单独CTCs测序数据:CTCs with fewer than 50 expressed genes and genes that were expressed in <1% cells were also filtered out.After filtering, the treatment-naïve, treatment responding and treatment relapsed samples had 637, 1,108 and 974 cells remaining, with the numbers of genes expressed ranging from 50–2,153.
初步处理:Seurat V2.3流程:
Normalize data
Scale Data(regress out G2/M and S phase cell cycle gene scores)
PCA(based on highly variable genes)
Elbowplot选dims
降维-RUNTSNE(default perplexity value of 30)
数据分析思路
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CDX数据样本聚类及常见肿瘤相关marker展示
同一样本内肿瘤marker表达不一致如MDA-SC49r里MYC、EMTscores表达不一致,体现了瘤内异质性的存在。
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CDX模型之间baseline ITH计算
选取前20个PC,计算细胞之间的平均Euclidean distance来计算ITH score。(对应图a)
通过dispersion of gene expression来衡量ITH:使用所有基因的normalized后的表达量,通过EdgeR包的estimateDisp()计算。(对应图b)
基于tSNE,计算每个样本的 the optimum number of clusters(cluster 包 Silhouette score 最大值时),可发现铂耐药组细胞cluster较多,有明显异质性。
差异表达基因表明铂敏感和耐铂CDX之间差异表达的基因只在单个CDX中检测到,而不是存在于在两个或更多耐药模型中。
GSEA分析揭示CDX模型各个cluster显著富集的通路,提示即使在一个肿瘤内部也有多个耐药相关信号通路共表达。
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CDX模型内部各cluster之间存在基因差异表达
运用heatmap和violinplot展示与SCLC治疗和耐药相关的基因在一个样本内部的各cluster间存在差异表达(如PARP1, CHEK1, AURKA, AURKB, DLL3, VIM, 及EMT scores等)。
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患者CTCs单细胞测序
分别从diagnosis, responding, relapsed三个时间点手机患者MDA-SC55血液中的CTC进行测序,质控降维聚类后发现两个cluster是CTCs。
提出CTCs,重新降维聚类,可得到5个不同的cluster,其中cluster1主要来自diagnosis时间点的CTC。
分别计算diagnosis时的CTC及relapsed时间点的CTC及CDX模型的ITH评分,发现relapsed时间点ITH评分更高。relapsed时间点CTC及CDX模型SCLC转移及耐药相关基因表达有所不同。
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CDX模型模拟患者化疗耐药过程
对MDA-SC68s CDX模型分别进行对照及cisplatin处理,当肿瘤体积增至1000mm3后取肿瘤进行单细胞测序。图c可看出对照组及cisplatin耐药复发组肿瘤细胞几乎无混合。
与对照组相比,cisplatin-treated CDX ITH score增高
与对照组比,cisplatin-treated CDX里 ASCL1明显下调,与药物耐药显著相关。cluster3 EMT score升高, DLL3特异性降低。提示在MDA-SC68s中,经过铂处理后,间充质细胞取代了对铂相对敏感的ASCL1阳性细胞。
作者接着用SCLC的靶向治疗药物PARPi及CHKi进行了如上述类似的实验及分析,提出PARPi与CHKi耐药机制可能不同。
临床意义
构建了可模拟SCLC疾病进展及转移的CDX模型;
化疗耐药后肿瘤异质性增加。同一肿瘤内部存在转录异质性,体现多种共存的耐药机制。提示SCLC在治疗初期应采用联合化疗方法。
CTCs转录谱在同一病人不同时间段存在异质性表达,提示可通过病人病程中连续取样,从而捕捉患者治疗靶点表达的动态变化。