单细胞实战(五) 理解cellranger count的结果
实战演练
理论知识学再好，能付诸实践灵活运用才行，所以我们常强调知行合一，实践出真知。实战演练这个栏目就是带大家从头到尾完整复现单细胞文献分析流程。好了，干货多，屁话少，我们来看实战流程。
希望大家能有所收获！
Cellranger结果
Cellranger的结果力求与常规分析的结果格式相同，比如它生成的 barcoded BAM files 也可以放到IGV中查看比对质量
count结果一般放在out目录下，主要有summary和analysis两大类，包含以下几项：
Summary
这是一个html格式的文件，直接下载到本地打开
打开时就能对数据进行一个判断，网页顶端颜色显示为黄色或者红色说明数据存在异常
然后点击Details，可以看到为何数据出错：
结果部分包括实验捕获的细胞数目、检测到的基因数目、测序数据的产出与质量统计、参考基因组的比对情况
(第一张为V2试剂的结果)
(第二张为V3试剂的结果)
几个指标可以关注一下：
左上部分中，包括了reads数、barcodes数、UMI、index、Q30等统计值
左下是reads比对的比例，包括基因间区、外显子、内含子，如果比对率太低(一般认为外显子的比对率要在60%以上)
右上图是利用barcodes上的UMI标签分布来估计细胞数，绿/蓝色表示细胞，灰色表示背景，其中Y轴表示每个barcode对应的UMI数量，X轴是一定数量的UMI序列所对应barcode的数量，比如上图中有1000个barcodes含有10k个UMI，细胞过滤就是通过这个图来展示的。
首先明确，barcode用来区分细胞，UMI用来区分转录本；其次，barcodes数量是要大于细胞数量的（以保证每个细胞都会有barcode来进行区分）
下面👇是在对原文数据进行count时遇到的一个问题，记录下来
原文的小坑
其实有了参考信息与原始序列，跑一个count命令并不难，但是对于这篇文章来讲，有一个小坑需要注意：看原文的方法描述
原文是需要将hg38和Merkel cell polyomavirus, MCPyV(默克尔细胞多瘤病毒)的基因组共同作为参考序列去比对，基本操作流程类似这样：
其中，hg38的fasta与gtf获取比较容易，直接下载即可(具体见"单细胞实战(四) Cell Ranger流程概览")，但是作者还用到了这个MCPyV，它的基因组也是比较容易获得https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010277，但是gtf怎么获得是个问题，作者给出的解答是：需要用基因组fasta自己生成gtf文件
这个思路很重要，但是如何将基因组fasta转为gtf，还是个问题，于是本着"自己的锅自己背"的原则，又去问了作者
本以为人家不会给回信息，因为问的问题好像有点和他们文章没什么关系了，但他真的回信了并且很负责告诉我："他也不会！"，解决办法就是：手动构建一个
其实这个事情可以告诉我们，复现文章中遇到问题时，直接和原作者沟通是最有效的方式（这是我第一次和一作直接进行交流）。之前的时间都是自己在摸不着头脑地进行各种尝试，然后找代码，结果都不可以成功
先把基因组序列下载下来
然后根据genbank的序列信息，造出5个CDS的注释信息
基本就按照这个样子来就好，不需要很复杂
需要注意的是，cellranger只能识别exon，所以我们也要这样设计
# 每一行有9列tab分隔信息
# 第一列：Chromosome 指定基因组上染色体或contig位置
# 第二列：Source 这个用处不大
# 第三列：Feature CellRanger软件只取exon的部分
# 第四列：Start 起始位点(1-based)
# 第五列：End 终止位点(1-based)
# 第六列：Score 这个用处不大，建议用"."表示
# 第七列：Strand feature信息在基因组的+或-链
# 第八列：Frame 用处不大，建议“.”
# 第九列：分号分隔的键值对，重点是transcript_id 和gene_id。gene_name可选
ADE45414.1_1 Gnomon exon 465 1190 . - . gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45415.1_2 Gnomon exon 1156 2427 . - . gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45416.1_3 Gnomon exon 2503 4722 . - . gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45416.1_3 Gnomon exon 5154 5387 . - . gene_id "1"; transcript_id "1.1";
ADE45417.1_4 Gnomon exon 4827 5387 . - . gene_id "1"; transcript_id "1.1";
但是自己构建时，一定要注意使用tab分隔，即使看上去像也不可信，检查的方法有两个：
一个是直接运行cellranger mkgtf 看是否报错，可能会提示：GTF的行数不对；
另一个是直接检查：awk -F '\t' '{print NF}' mcv.gtf，如果显示1，那么说明没有tab分隔，而是用的多个空格，利用sed可以把这些空格替换成tab：
sed 's/ \+ /\t/g' inputfile > outputfile