全人源抗体转基因小鼠构建技术原理

全人源抗体转基因小鼠技术之所以诞生以来一直官司缠身，主要原因是技术体系和方法有限。将小鼠的内源免疫球蛋白基因失活，有以下几种不同的策略：

策略1

将鼠免疫球蛋白基因重链和轻链的J区敲除，该策略的原理是通过阻断VDJ重排过程，阻止小鼠内源性抗体生成，如 HuMAb和Xenomouse。

策略2

将小鼠免疫球蛋白基因重链VDJ区倒置，扰乱顺式作用元件与编码区的调控作用，阻止小鼠内源性抗体生成，但是小鼠内源V、D、J区仍然存在，如Kymouse.

策略3

在小鼠免疫球蛋白基因上游的调控区插入转录终止元件stop cassette，关闭基因转录，阻止小鼠内源性抗体生成，但是小鼠内源V、D、J区仍然存在，如OminiRat/Mouse、 H2L2 Tg Mice。

策略4

将小鼠免疫球蛋白基因重链V、D、J，轻链V、J区全部敲除，是最彻底的阻断鼠源抗体生成的策略，完全避免了鼠源抗体基因表达泄露、灭活不充分的风险，如Veloclmmune mouse。

将人源免疫球蛋白基因导入小鼠基因组则更难，如果基因导入的技术策略相似，导入的人源抗体基因的序列和敲入位点也基本相似，则很容易产生专利纠纷。为了使导入小鼠基因组的人免疫球蛋白基因正常表达，各公司基本采用了将人源基因在C区上游定点敲入、或将小鼠的同源基因原位替换的策略，以保证基因表达调控不受影响。

然而人免疫球蛋白基因相当庞大，IGH 约2Mb，IGK 约2Mb，IGλ 约1Mb，无论是采用同源重组还是位点特异性重组，都受到重组载体容量的限制。大多数公司采用的基因导入载体是BAC/YAC，BAC的容量在100kb，YAC的容量在1Mb，如果采用同源重组基因敲入策略，每个重组载体两端还要保留足够长的同源序列，想要将全部人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组，就成为一项极限挑战！目前该记录的保持者是Regeneration通过9次基因打靶导入大约1.0Mb人IGH，其中包含了绝大多数的80个VH区，和几乎全部的DH和JH区。但这仍不是全部的人 VH-DH-JH序列，除了未导入人的CH区，还删掉了一些功能未知的间隔序列。