科研 | 山西农业大学：生理，代谢和转录组分析揭示了拟南芥幼苗对碳纳米角的响应（国人佳作）
编译：Mr. Left，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Physiological, Metabolic, and Transcriptomic Analyses Reveal the Responses of Arabidopsis Seedlings to Carbon Nanohorns
译名：生理，代谢和转录组分析揭示了拟南芥幼苗对碳纳米角的响应
期刊：Environmental Science & Technology
IF：6.667
发表时间：2020.3
通讯作者：徐进
通讯作者单位：山西农业大学
DOI号：https://doi.org/10.1021/acs.est.9b07133
摘要图
实验设计
结果与讨论
1 单壁碳纳米角对植物生长的影响
将五日龄的拟南芥野生型Col-0幼苗转移到含有不同浓度单壁碳纳米角（SWCNHs）的新鲜培养基中，生长1-4天。处理1天后，主根（PR）的生长不受影响（数据未显示）；然而，分别用50和100 mg/L SWCNHs处理2天后，PR的生长分别被抑制了12.5％（±0.07％）和18.5％（±0.11％），处理4天后，其抑制率分别为10％（±0.06％）和12.7％（±0.08％）（图1a）。但是，分别用0.05和0.1 mg/L SWCNHs处理4天后，PR的增长分别增加了16％（±1.1％）和19％（±0.07％）（图1中的图a和b），表明低浓度 的SWCNH促进PR增长。接下来，我们研究了低浓度的SWCNHs对侧根（LR）生长的影响。补充0.1 mg/L SWCNHs会诱导LR的形成。侧根原基（LRP）形成的第一阶段，第四阶段和总LRP数量分别提高了15％（±0.12％），64.6％（±0.34％）和20％（±0.17％），表明低浓度的SWCNHs在起始和延伸过程中也促进LR的形成（图1c）。
为了进一步阐明低浓度的SWCNHs促进PR生长的作用，作者测量了分生区和伸长区的长度。在0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中，分生区和伸长区的长度均增加（图1的d和e栏）。分生区带长度的增加表明该区内的细胞分裂层数增加，而伸长区长度的增加表明该区内的细胞伸长增加。这些结果表明SWCNHs在促进根尖的分生组织活性和细胞伸长中起作用。
除增加PR长度和LR数量外，0.1 mg/L SWCNHs还改善了叶片的生长。如SI图S1所示，处理2周后，处理过的幼苗大于未处理的对照植株。综上所述，这些结果表明低浓度的SWCNHs促进根系发育和叶片生长，进而促进植物生长。
图1 单壁碳纳米角（SWCNHs）影响拟南芥幼苗的生长。（a）用0、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1、5、10、50和100 mg/L SWCNHs处理5日龄的拟南芥Col-0幼苗2天和4天，然后测量主根（PR）的生长。（b–e）用0（对照）和0.1 mg/L SWCNHs处理5日龄的拟南芥Col-0幼苗4天（b），然后测量侧根原基（LRP）形成（c），分生区长度（d）和延伸区长度（e）。比例尺= 1 cm。误差棒代表SE（n = 3；12个植物/处理/重复）。不同的字母表示显著不同的值（根据Tukey检验，P <0.05），星号表示与对照（0 mg/L SWCNHs）的显著差异（学生的t检验，P <0.05）。
2 单壁碳纳米角改善拟南芥根尖中的干细胞巢活性和分生细胞分裂能力
为了进一步了解SWCNHs如何调节植物生长，作者使用RNA测序对经过或未经过0.1 mg/L SWCNH处理的拟南芥Col-0幼苗进行转录组分析。在0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中共鉴定出295个差异表达基因（DEG），包括192个（65.1％）上调的基因和103个（34.9％）下调的基因（log2倍数变化（FC）≥1或≤−1，P <0.05）（SI图S2，SI表S3）。为了证实转录组数据的可靠性，通过qRT-PCR检验了参与干细胞发育，生长素生物合成以及初级和次级代谢的十个基因的表达。qRT-PCR结果显示出与转录组数据良好的一致性（SI图S3）。
在SWCNH处理的幼苗中，两个与干细胞发育相关的基因，即WUSCHEL相关的同源异形基因1（WOX1）和WOX5的表达上调（图2a，SI图S3和表S3），且细胞周期基因CYCLIN-U1-1的表达也被上调（图2a，SI表S3）。为了进一步确认结果，使用了静止中心（QC）特定标记系WOX5:GUS和QC25:GUS来检测干细胞活性。在SWCNH处理的WOX5:GUS（图2中的图b和c）和QC25:GUS（SI图S4）中，GUS活性高于未处理的对照植株，尤其是在处理2天和4天后。接下来，我们使用pCYCLINB3; 1：CYCLINB3; 1-GUS转基因报告基因系检测分生细胞分裂（图2中的图d和e）。用SWCNHs处理1天和2天后会增加CYCLINB3; 1-GUS在根尖的表达，并且在处理4天后该表达逐渐恢复到正常水平。但是，转录组分析未揭示CYCLINB3; 1基因表达的改变。细胞周期相关蛋白的表达在转录和转录后水平上均受到严格调节。这些蛋白在细胞周期中迅速合成并被降解，以确保下一周期的细胞分裂。这些结果暗示了在SWCNH处理的幼苗中CYCLINB3; 1潜在的转录后调控，且需要进一步阐明。综上所述，这些结果表明低浓度的SWCNHs通过增加根尖中的干细胞巢活性和分生细胞分裂潜能而增加分生区的长度。
图2 单壁碳纳米角（SWCNHs）影响拟南芥根尖中的干细胞巢活性和分生细胞分裂潜能。（a）根据转录组数据显示的参与干细胞发育和细胞周期的基因表达的log2倍数变化（FC）的热图。详细的基因表达信息请参见SI表S3。（b，c）用0.1 mg/L SWCNHs处理1天，2天和4天的5日龄的WOX5-GUS幼苗的根尖的GUS染色图像（b）和WOX5-GUS的相对GUS活性（c）。（d，e）用0.1 mg/L SWCNHs处理1天，2天和4天的5日龄CYCLINB3; 1-GUS幼苗的根尖中GUS染色的图像，CYCLINB3; 1-GUS的相对GUS活性（e）。比例尺＝100 μm。误差棒代表SE（n = 3；每处理/重复12株植物），不同的字母表示显著不同的值（根据Tukey的检验，P <0.05）。
3 生长素参与单壁碳纳米角促进的根系生长和发育
生长素在调节根尖干细胞活性中起着重要作用。我们研究了0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中的DEG，发现参与生长素生物合成的两个基因，即YUCCA 3（YUC3）和YUC5的表达上调（图3a，SI图S3和表S3），且三种生长素应答基因SAUR71，SAUR72和SAUR77的表达上调（图3a，SI表S3）。因此，作者通过使用表达生长素应答报告基因DR5::uidA的DR5-GUS转基因系，研究了SWCNHs是否影响根尖中的生长素积累。在处理1天和2天后，与未处理的对照组相比，添加0.1 mg/L SWCNHs会引起根尖中生长素的快速积累，并且该水平在处理4天后逐渐恢复到正常水平，如DR5-GUS染色所示（图3中的面板b和c）。根系发育受生长素浓度的严格控制；也就是说，低浓度的生长素会促进PR延伸，而高浓度的生长素则会抑制PR延伸并诱导LR形成。YUC3和YUC5基因在根中高度表达，并有助于这些器官中的生长素生物合成。YUC3，YUC5，YUC7，YUC8和YUC9（yucQ突变体）同时失活会导致根部生长素缺乏，从而抑制PR和LR的生长和发育。外源生长素能弥补yucQ突变体的根缺陷表型，而芽中生长素的过量生产却不能，这表明根中局部生长素的生物合成在根系发育中起着至关重要的作用。生长素在根中的积累抑制会减少LR形成的第一个横向细胞分裂，从而破坏LRP的形成。用0.1 mg/L SWCNHs处理1天和2天后会导致生长素在根尖积累；因此，作者观察到SWCNH处理过的根中PR生长的增加，这表明根中生长素在根中的积累增加有利于根的发育。处理4天后，生长素的水平逐渐恢复至正常水平。SWCNHs诱导的生长素快速积累改变了根中的生长素分布，而及时恢复到正常水平则确保了根尖维持正常的生长素梯度，这有利于根的发育。
根尖中的生长素分布受到生长素载体的严格控制。作者使用生长素内流载体报告基因系pAUX1:AUX1-YFP和生长素流出载体报告基因系pPIN1:PIN1-GFP，pPIN2:PIN2-GFP，pPIN3:PIN3-GFP和pPIN4:PIN4-GFP检测了生长素载体的表达。暴露于0.1 mg/L SWCNHs后，处理1天和2天后PIN2-GFP的丰度显著提高，处理4天后逐渐恢复到正常水平（图3中的图d和e）。但是，AUX1-YFP（SI图S5的图a和b），PIN1-GFP（SI图S5的图c和d），PIN3-GFP（SI图S5的图e和f）和PIN4-GFP丰富（SI图S5中的图g和h）不受影响。PIN2丰度的增加促进了生长素的运输，从而在根尖维持了动态的生长素平衡。综上所述，这些结果表明低浓度的SWCNHs通过诱导生长素的生物合成和增加PIN2的丰度来调节根尖中的生长素分布，从而影响干细胞活性并改善PR生长和LR形成。但是，PIN2如何参与0.1 mg/L SWCNH介导的PR生长需要进一步阐明。
图3 单壁碳纳米角（SWCNHs）影响拟南芥根尖中生长素的积累。（a）根据转录组数据显示的生长素生物合成相关基因和生长素应答基因表达的log2倍数变化（FC）热图。详细的基因表达信息请参见SI表S3。（b，c）用0.1 mg/L SWCNHs处理1天，2天和4天的5日龄DR5-GUS幼苗的根尖的GUS染色图像（b）和DR5-GUS的相对GUS活性（c）。（d，e）用0.1 mg / L SWCNHs处理1天，2天和4天的5天大的PIN2:GFP（d）幼苗的根的GFP荧光，以及PIN2:GFP（e）荧光强度的定量。比例尺=100 μm。误差棒代表SE（n = 3；每处理/重复12株植物），不同的字母表示显著不同的值（根据Tukey的检验，P <0.05）。
4 单壁碳纳米角重编程植物代谢
为了阐明低浓度SWCNHs对拟南芥幼苗的促进作用，作者使用了气相色谱-质谱法（GC-MS）来鉴定响应于0.1 mg/L SWCNH处理而发生变化的代谢物。在拟南芥幼苗中共鉴定并半定量了283种代谢物。使用t检验，首先筛选了SWCNH处理的幼苗中显著变化的代谢产物（P <0.05）。与未处理的对照处理相比，0.1 mg/L SWCNH处理植株中有13种代谢产物的水平（L-丝氨酸，L-甲硫氨酸，3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮，甲基马来酸，次黄嘌呤，纤维四糖，3,4',5,6,7-五甲氧基黄酮，5-羟色胺，2,3,4-三甲氧基扁桃酸，表儿茶素，糠醇，乙醇酸和β-谷甾醇）发生了显著变化（SI图S6）。接下来，作者对所有代谢物进行了对照和SWCNH处理的幼苗的PCA分析。PCA得分图表明，对照组与SWCNH处理组明显分开（SI图S7a）。从有监督偏最小二乘判别分析（PLS-DA）获得了相似的结果，结果表明，对照组沿PC1与SWCNH处理组分开，这解释了40.3％的变化（SI图S7b）。这些结果表明低浓度的SWCNHs改变了拟南芥的代谢产物谱。然后，通过PLS-DA模型的VIP得分（VIP> 1）筛选了SWCNH处理的幼苗中其水平发生显著变化的代谢物（SI图S7c）。SI表S4汇总了基于t检验（P <0.05）和VIP值（VIP> 1）显著变化的代谢物。
暴露于0.1 mg/L SWCNHs增加了拟南芥幼苗中的海藻糖，纤维四糖和龙胆二糖水平，但降低了D-木糖水平（图4）。就能量状态的调节和碳利用效率而言，海藻糖代谢是植物的重要调节途径。海藻糖代谢的变化调节糖代谢，尽管其潜在的详细分子机制仍不清楚。除糖以外，在SWCNH处理的幼苗中还观察到几种有机酸含量的变化，包括四种有机酸（甲基马来酸，表儿茶素，乙醇酸和3-氨基异丁酸）含量的减少和四种有机酸（咖啡酰酒石酸，2-氨基-2-去甲菠烷羧酸，5-羟基吲哚-2-羧酸和2,3,4-三甲氧基扁桃酸）的含量增加（图4）。有机酸是碳代谢的中间产物，在调节植物能量状态，质子泵，胁迫响应和次生代谢产物的生物合成中起重要作用。例如，表儿茶素可以充当原花青素合成的引发剂，而咖啡酰酒石酸是植物中多酚氧化酶的底物。与多酚相关的化合物的上调可通过清除活性氧（ROS）来增强植物对非生物或生物胁迫的耐受性。已知代谢物3-氨基异丁酸可调节系统抗性。防御分子组成和水平的变化暗示SWCNHs调节植物对环境胁迫的耐受性。另外，乙醇酸是乙醛酸循环的重要组成部分调节植物的碳代谢。
此外，基因本体论（GO）功能分析表明，生物学过程途径是显着富集的途径之一，其中属于“胁迫响应”类别的115个基因的表达被上调（SI图S8），表明 0.1 mg/L SWCNH诱导拟南芥幼苗的胁迫响应基因表达。这些结果表明，0.1 mg/L SWCNH调节胁迫耐受性，但还需要其他实验。
生物途径分析表明，水平显著变化的代谢产物在参与氨基酸代谢的四个途径中被富集（SI图S9）。氨基酸是氮同化的第一个稳定产物，氨基酸浓度的变化会影响植物的整体代谢状态，尤其是氮代谢。SWCNH处理的幼苗中三种氨基酸的水平发生了显著变化：两种氨基酸（丝氨酸和谷氨酸）的水平被下调，而一种氨基酸（甲硫氨酸）的水平被上调（图4）。谷氨酸作为转氨反应的主要氨基供体，在氮代谢中起关键作用。丝氨酸是一碳单位的主要来源，是一碳代谢的基础。丝氨酸还参与细胞增殖所需的几种生物分子的生物合成，包括含氮碱基，神经鞘脂和磷脂。丝氨酸和谷氨酸的积累减少表明0.1 mg/L SWCNHs不会诱导丝氨酸和谷氨酸的生物合成。但是，在0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中，没有检测到任何与这两种氨基酸的生物合成或降解有关的DEG（图5）。甲硫氨酸及其衍生物参与许多基本的生物学过程，包括蛋白质合成；多胺，亚精胺和精胺的形成；S-腺苷甲硫氨酸依赖性的甲基转移；以及转硫作用途径代谢产物的合成。补充0.1 mg/L SWCNH可以提高拟南芥幼苗的甲硫氨酸水平；然而，该研究未发现与甲硫氨酸的生物合成或降解有关的任何DEG，只有两个参与S-腺苷蛋氨酸代谢的基因，即ACS6和ACS11，在0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中表现出表达增加（图5）。这些结果表明，丝氨酸和谷氨酸的积累减少和甲硫氨酸的积累增加可能是间接机制。考虑到添加0.1 mg/L的SWCNHs可以改善植物的生长（图1，SI图S1），丝氨酸和谷氨酸的积累减少可能是由于生长增加导致的消耗。此外，这些结果表明，0.1 mg/L SWCNH的生长可能不是由SWCNHs对这些氨基酸代谢的直接调节所致。但是，需要进一步阐明详细的分子机制。
图5 根据转录组数据显示初级和次级代谢相关基因表达log2 fold change (FC)的热图(P < 0.05)。
该研究还观察到0.1 mg/L SWCNHs增加了几种次级代谢产物的水平，例如烟酰胺，两种嘌呤（次黄嘌呤和腺嘌呤）和两种黄酮（3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮和3,4',5,6,7-五甲氧基黄酮）（图6）。烟酰胺是辅酶因子NAD和NADP的组成部分，可以调节植物中次级代谢产物的积累。嘌呤在能量供应，代谢调节和辅酶组成中具有重要作用。黄酮具有广泛的生物活性，包括抗氧化剂活性和生长素运输和积累的调节活性，因此，它们可以通过ROS途径和生长素途径调节植物的生长和发育。这些代谢物的增加可能解释了就SWCNH处理的幼苗而言，植物的生长有所改善。
为了进一步阐明SWCNH介导的植物中的代谢重编程，作者还研究了0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中的DEG。为了支持代谢组学结果，DEG在KEGG途径分析中被富集：碳水化合物代谢（43.2％），氨基酸代谢（29.7％），脂质代谢（18.9％）和次级代谢（24.3％）（图5，SI图S10）。用SWCNHs处理可在拟南芥幼苗中诱导两个海藻糖6-磷酸合成酶（TPS）基因TPS8和TPS11的表达（图5），进一步证实SWCNHs影响海藻糖代谢，从而调节植物的碳利用效率。除TPS8和TPS11外，参与碳水化合物，氨基酸和脂质代谢的几种编码酶或调节剂的基因的表达在SWCNH处理的幼苗中被上调或下调（图5）。
有趣的是，作者还注意到用0.1 mg/L SWCNHs处理会上调七个细胞壁生物合成相关基因（CSLD1，XTH22，XTR6，At2g43890和At3g09405，以及过氧化物酶基因PER1和PER62）的表达（图5，SI图S3）。先前的研究表明，纳米颗粒可以粘附在细胞壁上，从而影响细胞壁结构和随后的细胞生长。该研究的结果进一步支持了纳米材料通过转录调控和物理相互作用来调节细胞壁的组织来调控细胞的生长。补充0.1 mg/L的SWCNHs还调节了几个与次级代谢相关的基因的表达，例如参与类黄酮生物合成和代谢（UGT73C6，FLS4，At3g29670和At3g29680），类胡萝卜素生物合成（CYP707A3），萜类化合物骨架的生物合成（GGPPS9），以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢（PCO1）的基因（图5）。
此外，GO功能分析揭示了生物学过程途径，其中46个和45个基因的表达分别属于“对氮化合物响应”类别和“对有机氮化合物响应”类别（Q值<0.001），是一条显著富集的途径（SI图S8），进一步支持了0.1 mg/L SWCNH调节拟南芥幼苗氮代谢相关基因表达的想法。综上所述，结合代谢组学结果，该研究的转录组结果表明，SWCNHs可重编程初级和次级代谢，从而影响植物的能量供应并调节植物的生长。
转录组分析的另一个有趣发现是，对DEG的鉴定揭示了编码转录因子（TFs）的大部分基因（34个TF，92％）的表达上调，包括所有鉴定出的编码WRKYs（6个基因），ERF（10个基因），ZAT（4个基因），Trihelixs（2个基因），LBD（2个基因），GRAS（2个基因），AP2-ERF（1个基因），NF-YB（1个基因），DREB（1个基因），ZF-HD（1个基因），C3H（1个基因），WOX（1个基因）和MYB TF（3个中的2个）的DEG；然而，在0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中，仅编码3个TF（8％）的基因的表达被下调，包括1个MYB，1个PLAZ和1个bZIP TF（log2倍数变化（FC）≥1或≤− 1，P ＜0.05）（SI图S2b和表S5）。LBD通过生长素途径在调节LR的生长和叶片发育中起着至关重要的作用。在0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中，LBD3和LBD41的表达上调，表明0.1 mg/L SWCNH通过调节LBDs的表达来改善LR的形成。生长素响应性SCARECROW（SCR）是植物特异性GRAS家族的成员，参与调节根和叶生长的各个方面。MYB77通过整合ABA和生长素信号转导途径调节根系生长。这些TFs的上调表达有利于生长素介导的植物生长。在0.1 mg/L SWCNH处理的幼苗中，与生物和非生物胁迫响应有关的几种TF的表达，例如WRKYs，ERF和ZAT，也明显被上调。WRKY40，WRKY46和WRKY70也调节植物的生长和氨基酸代谢。这些TF的表达上调表明0.1 mg/L SWCNH影响植物对胁迫的响应。用0.1 mg/L SWCNHs处理还抑制了拟南芥幼苗中MYB69，PLATZ基因At1g43000和bZIP42基因的表达；然而，潜在的分子机制仍不清楚。先前的研究已经表明，纳米颗粒会影响与生物和非生物胁迫相关的基因的表达。MWCNTs调节许多参与代谢过程和对胁迫响应的基因。此外，与先前的研究一致，对纳米材料与植物相互作用的一些研究（Ag纳米粉，纳米Cu，CeO2，SiO2，TiO2和Fe3O4纳米颗粒）表明，纳米颗粒可以调节植物的氨基酸代谢途径。这些结果表明，纳米材料对代谢途径和胁迫响应的调控可能是纳米材料与植物相互作用的普遍机制，但是详细的分子机制需要进一步阐明。
总结
近年来，碳基纳米材料在基因工程和可持续农业方面表现出巨大潜力。与CNT相比，SWCNHs具有更多的优势，具有较高的应用价值（例如尺寸均匀，在溶剂中具有良好的分散性以及无需催化剂即可大规模合成的能力）。因此，阐明SWCNHs对植物生长的生物学作用对于安全应用这些纳米材料很重要。该研究结果表明，低浓度的SWCNHs（0.1 mg/L）通过调节根中的生长素分布有效地促进了根系的生长和发育。转录组和代谢组学数据表明，SWCNHs重编程植物代谢，尤其是碳/氮代谢。观察到几种次生代谢产物的产量增加，进一步支持了SWCNH在促进植物生长中的作用。需要进一步研究阐明（i）高浓度的SWCNHs（> 50 mg/L）如何抑制PR生长，以及（ii）SWCNHs如何调节基因表达和代谢途径。
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