科研│东北农业大学：基于全转录组miRNA-mRNA网络分析揭示了镉致鲤鱼脾脏炎症免疫抑制损伤的机制 （国人佳作）
编译：微科盟 伊安，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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镉(Cd)是一种毒性很大的重金属元素,会对鱼类造成伤害。MicroRNAs可以参与炎症反应和免疫抑制，但在Cd干预的鲤鱼中，miRNAs的作用机制尚不清楚。本研究将 54 只幼鱼随机分为对照组和Cd组 (0.26 mg L-1 Cd)，培养30天。结果表明：镉干预后鲤鱼脾脏出现炎性损伤，有23个差异表达的miRNA，包括17个上调表达的miRNA(miR-1-4-3p、miR-7-1-5p、miR-7-2-5p、miR-10-43-5p、miR-34-3-5p、miR-128-4-3p、miR-128-5-3p、miR-132-2-5p、miR-132-6-5p、miR-216-3。MiR-375-7-3p、miR-375-8-3p和miR-724-5p)和6个下调差异表达的miRNAs(miR-9-6-5p、miR-25-9-3p、miR-31-3-5p、miR-31-12-5p、miR-103-5-5p和miR-122-1-3p)。KEGG和GO分析表明5条通路(NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、Th1型和Th2型细胞分化通路、Toll样受体信号通路)和7 GO项(免疫系统过程负调节、T细胞介导的免疫、免疫反应调节、炎症反应调节、炎症反应正调节、炎症反应调节和炎症小体复合物)与炎症反应和免疫抑制相关。转录组测序和RT-qPCR结果表明，镉干预后，鲤鱼脾脏的miR-375-4-3p、NF-κB、COX-2、PTGES和IL-4/13A水平升高，miR-31-12-5p、miR-9-6-5p、MMP9、IL-11、SpI1和T-Bet水平下降。本研究结果表明，基于全转录组的miRNA-mRNA网络分析表明，在鲤鱼脾脏中，miRNAs介导了镉引起的炎症免疫抑制损伤。本研究为镉暴露的毒理学提供了新的见解。
论文ID
原名：Whole transcriptome-based miRNA-mRNA network analysis revealed the mechanism of inflammation-immunosuppressive damage caused by cadmium in common carp spleens
译名：基于全转录组的miRNA-mRNA网络分析揭示了镉致鲤鱼脾脏炎症免疫抑制损伤的机制
期刊：Science of the Total Environment
IF：6.551
发表时间：2020年5月
通讯作者：滕小华
通讯作者单位：东北农业大学动物科技学院
DOI号：10.1016/j.scitotenv.2020.137081
实验设计
结果
1 形态结构
光镜下观察鲤鱼脾脏的病理结构，如图1所示。对照组(图1A1和A2)鲤鱼脾脏组织结构完整，染色均匀，如红细胞(RBC)和淋巴细胞(Ly)。对于CD组(图1B1-B4)，观察到以下组织结构：与对照组(图1 A1)相比，红髓(RPS)较小(图1B1)。血管内皮细胞(VEC)纤维素样肿胀、染色不均和炎症反应(图1 B1和B2)。与对照组(图1 A2)相比，有大量的炎症细胞(IC)(图1 B2)、红细胞(图1 B3)和含铁血黄素(HS)(图1 B4)。
图1.脾切片HE染色：A1、B1为100倍放大镜，A2、B2、B3、B4为400倍放大镜，A1、A2为对照组，A2为A1的一部分。B1、B2、B3、B4：CD组脾切片。B2、B3和B4分别是B1的不同部分。
表1.RT-PCR验证序列。
2 miRNA测序
为了研究Cd对鲤鱼脾脏miRNA的影响，进行了miRNA测序，获得了23个同时满足|log2FC|＞0.585(图2A)和p-value＜0.05(图2B)两种条件的差异表达miRNAs。23个差异表达的miRNA在热图中显示(图2C), 其中17个表达上调的miRNA来自9个miRNA家族(miR-1-3p、miR-7-5p、miR-10-5p、miR-34-5p、miR-128-3。和miR-724-5p)和6个下调的miRNA来自5个miRNA家族(miR-9-5p、miR-25-3p、miR-31-5p、miR-103-5p和miR-122-3p)。
图2.MiRNA测序结果。A：|log2FC|＞0.585；B：Log10差异miRNA直方图(P值).C：直观反映Cd组和对照组鲤鱼脾脏差异miRNA表达的热图。
表2.上调的miRNA及其靶mRNA数量。
3 miRNA和mRNA序列的共分析
为了揭示miRNAs的功能，研究人员利用Miranda软件和鲤鱼基因组序列预测了miRNAs潜在的靶mRNA。将获得的潜在靶mRNA映射到先前实验的mRNA-seq结果中，获得了潜在差异表达的靶mRNA。根据miRNA对mRNA的负调控作用，研究人员获得了差异表达的靶mRNA。表2和表3列出了潜在靶mRNA、潜在不同表达靶mRNA和不同表达靶mRNA的数量。去掉重复的mRNAs，获得了2022个差异表达的靶mRNA。在17个上调的差异表达miRNAs中有1113个下调表达的靶mRNAs，在6个下调的差异表达miRNAs中有909个上调的差异表达靶mRNAs，如表2和表3所示。研究人员发现两个miRNA-mRNA网络。一个miRNA-mRNA网络由17个上调的差异表达miRNA和1113个下调的差异表达mRNA组成(图3A)，另一个miRNA-mRNA网络由6个下调的差异表达miRNA和909个上调的差异表达mRNA组成(图3B)。
表3.下调的miRNA及其靶mRNA数量。
图3.MiRNAs与其靶基因mRNAs之间的共分析网络。红色代表基因(miRNAs和mRNAs)下调，绿色代表基因(miRNAs和mRNAs)上调。△代表miRNA，○代表mRNA。
4 miRNAs靶mRNA KEGG和GO分析
利用KEGG和GO对2022个差异表达的miRNA进行分析，得到10条途径(图4)和9个注释簇(图5)。这10条途径包括果糖和人神经代谢途径、戊糖磷酸途径、糖酵解/糖原合成途径、碳代谢途径、氨基酸生物合成途径、核因子-κB(NF-κB)信号途径、JAK-STAT信号途径、MAPK信号途径、Th1型和Th2型细胞分化通路、Toll样受体信号通路。
对于注释簇，注释簇1包括3项(包括苯丙氨酸-tRNA连接酶复合物、苯丙氨酸-tRNA Li-Gase活性和苯丙氨酰-tRNA氨基酰化)。注释簇2包括41项(其中23项与单加氧酶活性有关，16项与羟化酶活性有关，2项与氧化酶活性有关)。注释簇3包括3项(包括逆转录病毒3'处理活性、逆转录病毒3’处理活性和磷酸酯水解酶活性)。注释簇4包括3项(包括动蛋白复合体、微管运动活性和基于微管的运动)。注释簇5包括3项(包括细胞周期素依赖性蛋白Ki-鼻全酶复合物、细胞周期素依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正调控和细胞周期素依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性)。注释簇6包括3项(包括蛋白酶体核心复合体、α亚单位复合体、苏氨酸型内肽酶活性和蛋白某些核心复合体)。注释簇7包括38项(其中34个项涉及转移酶活性，2项涉及合成酶活性，1项涉及软骨素水解酶活性，1项涉及O抗原聚合酶活性)。注释簇8包括4项(包括钙离子依赖性胞吐的调节、钙离子调节的神经转运体的胞吐、囊泡融合和合成素结合)。注释簇9包括10项(包括凋亡过程的调节、MAPK级联的调节、免疫系统的负调节、T细胞介导的免疫、免疫应答的调节、炎症反应的调节、自噬小体、炎症反应的正调节、炎症反应的调节和炎性小体复合体的调节)。
图4.10条靶mRNAs通路。ko00051:果糖和甘露糖代谢,ko00030:磷酸戊糖途径,ko00010:糖酵解/糖质新生,ko01200:碳代谢,ko01230:氨基酸的生物合成,ko04064:NF -κB信号通路,ko04630: JAk-STAT信号通路,ko04013: MAPK信号通路,ko04658: Th1、Th2细胞分化,和ko04620: toll样受体信号通路。
图5.靶mmRNAs的注释簇。
5 RT-qPCR验证miRNA-seq和mRNA-seq结果
为了验证miRNA-seq和mRNA-seq结果的可靠性，本研究利用RT-qPCR技术检测了注释簇9中的3个miRNA和8个mRNAs(引物见表1)。MiR-375-4-3p表达上调，miR-31-12-5p和miR-9-6-5p表达下调。NF-κB、环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E合成酶(PTGES)和基质金属蛋白9(MMP9) 等来自20个的mRNA进行了GO系那个高分析(包括炎症反应、炎症反应正调节、炎症反应调节和炎症体复合体)的检测(图6A)。从三个方面(包括免疫系统过程的负调控，T细胞介导的免疫，以及与免疫相关的免疫反应的调节)检测了T细胞中表达的白细胞介素(IL)-11，SPI1，T-box转录因子(T-Bet)，以及来自20个最重要的顶端mRNA的IL-4/13A(图6B)。验证试验表明，RT-qPCR的结果与miRNA和mRNA测序的结果一致(图7)。与对照组相比，CD组MIR-375-4-3p、NF-κB、COX-2、PTGES和IL-4/13AmRNA表达增强。CD组与对照组相比，miR-31-12-5p和miR-9-6-5p表达降低，MMP9、IL-11、SPI1和T-Bet mRNA表达降低。
图6.注释簇9中前20位靶mRNA免疫和炎症相关注释。
图7.使用RT-qPCR验证miRNA-seq和mRNA-seq结果。
讨论
MiRNAs参与动物体内的多种生物过程，并能调节细胞的分化、发育和稳态。Cd等危险物质可以改变miRNA。毒死蜱降低miR-19a的表达。Cd干预可降低鸡脾脏miR-33的表达。莠去津诱导的炎症反应受miR-181-5p调节。在本研究中，研究人员通过miRNA和mRNA测序发现，镉干预小鼠脾脏中有23个差异表达的miRNA和2022个靶mRNA。其中17个miRNAs表达上调，6个miRNAs表达下调。用KEGG和GO分析了2022个靶mRNA。获得了10条途径和9个注释簇，其中5条途径和1个注释簇与镉干预鲤鱼脾脏的炎症和免疫相关。
在本实验中，研究人员通过KEGG发现3条途径(NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路和Toll样受体信号通路)参与了镉干预鲤鱼脾脏的炎症反应。其他研究人员通过转录组学检测mRNA证实了上述机制。3条途径(包括NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路和Toll样受体信号通路)是葡聚糖硫酸钠诱导的大鼠结肠炎的炎症相关通路。在感染病毒性败血病病毒的橄榄比目鱼头肾脏中有4种途径(包括NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路和Toll样受体信号通路)是与免疫相关的途径。炎症内反应的调节和炎症反应的正调节参与了人类炎症性乳腺癌的发生。下列GO术语与免疫功能有关：在珍珠鸡的6个组织(胰腺、下丘脑、肝脏、骨髓和法氏囊)中有2个GO术语(包括免疫系统过程的负调节和免疫反应的调节)；在鲈鱼的7个组织(脑、心脏、鳃、肝脏、肌肉、肾脏和胰腺)中有1个GO术语(包括T细胞介导的免疫)；在南极鲈鱼中有2个GO术语(包括炎症反应和炎症反应调节)。两项研究还发现以下GO术语与人类三种疾病(子宫内膜异位症、透明细胞癌和子宫内膜样癌)中的炎症反应、免疫反应调节和炎症体复合体功能有关。本研究发现MAPK级联调控的生物学功能属于注释簇9，但其调控MAPK级联的生物学功能尚不清楚，有待于进一步研究。另外，两项研究发现在斑马鱼感染金黄色葡萄球菌时，miRNAs通过NF-κB信号通路、Th1、Th2细胞分化和Toll样受体信号通路参与免疫机制；在鲤鱼脾脏中，miRNAs通过MAPK信号通路和Toll样受体信号通路参与免疫机制。与上述两项研究一致，在本研究中，在Cd干预鲤鱼中，miRNA通过NF-κB信号通路、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、Th1和Th2细胞分化以及toll样受体信号通路参与免疫相关毒性反应。以上讨论提示miRNAs参与了Cd引起的鲤鱼脾脏炎症/免疫抑制。此外，还发现miRNAs通过7 条GO术语(免疫系统过程的负调节、T细胞介导的免疫、免疫反应的调节、炎症反应的正调节、炎症反应的调节和炎症体复合体的调节)。
为了验证研究结果的可靠性，研究人员进一步利用RT-qPCR检测了注释簇9中的3个miRNAs和8个靶mRNAs。RT-qPCR结果与miRNA测序结果一致。过量Cd使鲤鱼脾脏miR-375-4-3P升高，miR-31-12-5P和miR-9-6-5P降低。过量镉使鲤鱼脾脏4个靶基因(NF-κB、COX-2、PTGES和IL-4/13A)表达上调，4个靶基因(MMP9、IL-11、SPI1和T-BET)表达降低。上述结果进一步支持了miRNAs介导的Cd诱导鲤鱼脾脏的炎症和免疫反应。有害因素可引发机体的炎症性损伤。研究发现miR-9-5p的上调通过抑制miR-9-5靶基因(NF-κBP50)对深静脉血栓形成大鼠的炎症反应具有保护作用。有研究报道，NF-κB、COX-2、PTGES和MMP9参与了炎症反应。例如，铅通过增加鸡睾丸NF-κB和COX-2mRNA的表达以及NF-κB蛋白的表达而引起炎症损伤。Cd诱导NF-κB、COX-2和PTGES mRNA表达，并引起炎症损伤。McMillan等人证实在MMP9基因敲除下，小鼠肺组织中变应原诱导的气道炎症增强。在本研究中，NF-κB、COX-2和PTGES表达上调，MMP9表达下调，表明miRNAs参与了镉所致鲤鱼脾脏的炎症反应。此外，形态学研究还发现，镉可引起鲤鱼脾脏的炎性损伤。
慢性炎症可诱导免疫抑制，促进口腔鳞状细胞癌的发生。上皮细胞特异性miR-375促进抗寄生虫Th2免疫应答，miRNA-31下调介导脓毒症患者原代T细胞免疫抑制。有报道发现IL-11、SPI1、T-Bet、IL-4/13与免疫功能密切相关。低浓度的IL-11可以抵抗免疫介导的人内皮细胞损伤。SPI1通过调控斑马鱼胚胎中的免疫相关基因来引导先天免疫。T-bet是一种1型免疫的关键调节因子。虹鳟鱼和大西洋鲑鱼IL-4/13A高表达增加，胸腺、鳃和皮肤的免疫环境呈Th2偏斜。此外，T-Bet和IL-4/13A分别由Th1细胞和Th2细胞产生。其他研究还发现，有害物质会导致Th1/Th2失衡和免疫抑制。本研究也与上述研究一致。在本实验中，T-Bet的降低和IL-4/13A的升高表明镉引起鲤鱼脾脏Th1/Th2的失衡和免疫抑制。
结论
在镉干预的鲤鱼脾脏中，有23个miRNAs差异表达(其中17个上调，6个下调)和2022个靶标mRNA。获得5条途径(NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、Th1型和Th2型细胞分化通路、Toll样受体信号通路)和7条GO(免疫系统过程负调节、T细胞介导的免疫、免疫应答调节、炎症反应调节、炎症应答正调节、炎症反应调节和炎性小体复合体)。转录组测序和RT-qPCR结果显示，镉可使鲤鱼脾脏miR-375-4-3p、NF-κB、COX-2、PTGES和IL-4/13A水平升高，miR-31-12-5p、miR-9-6-5p、MMP9、IL-11、SpI_1和T-BET水平降低。本研究通过miRNA-mRNA网络分析表明，miRNAs介导了鲤鱼脾脏的炎症-免疫抑制损伤。转录组分析是研究污染物(如重金属、杀虫剂、有害气体等)致有机体中毒机理的先进技术，可获得大量有效数据。然而，获得的miRNAs还需要用其他方法进行验证，如RT-qPCR。鲤鱼脾脏中的miRNAs和mRNAs可作为监测Cd水污染的生物标志物，有待进一步研究。