科研 | 德国癌症研究中心：PolyloxExpress条形码解析造血干细胞的克隆命运和单细胞转录组

编译：Champion，编辑：夏甘草、江舜尧。

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导读

为了解决不同命运下HSC克隆是否在转录谱差异这一问题，本研究设计了一个内源性RNA条形码系统PolyloxExpress，使用PolyloxExpress研究小鼠单个HSC克隆的命运（通过比较HSC和成熟谱系中的条形码）和转录组（通过单细胞RNA测序和条形码匹配），实现了在生理条件下对单细胞命运和转录组的联合读数。研究发现具有不同命运的HSC克隆位于造血转录的不同位置。本研究已鉴定的基因表达特征可能为探究单个基因在HSC命运调控中的作用提供一个切入点。

论文ID

原名：Resolving Fates and Single-Cell Transcriptomes of Hematopoietic Stem Cell Clones by PolyloxExpress Barcoding

译名：PolyloxExpress条形码解析造血干细胞的克隆命运和单细胞转录组

期刊：Cell Stem Cell

IF：20.86

发表时间：2020.08

通讯作者：Thomas Höfer&Hans-Reimer Rodewald

通讯作者单位：德国癌症研究中心

DOI号：10.1016/j.stem.2020.07.018

实验设计

研究人员首先在10x Genomics平台上用磁珠包裹细胞，流式细胞仪分选干祖细胞，接下来进行cDNA文库制备和扩增，对这些文库进行全转录组分析，并靶向Polylox扩增进行PacBio单分子实时（SMRT）测序。根据匹配单细胞的条形码和转录组从两个测序组中检索细胞指数。体内实验方面，通过建立Rosa26PolyloxExpress/+（称为Rosa26PolyloxExpress）小鼠，计数每只成年小鼠所有造血细胞中不同条形码的数量，分析出生后7-20周的小鼠单个HSC和祖细胞的条形码和全转录组。

结果

1 PolyloxExpress在单细胞中整合谱系信息和转录组

为了读取用于命运分析的条形码和转录组，本研究开发了Rosa26PolyloxExpress小鼠，其中条形码在基因组DNA中产生，并转录为mRNA。原始的Polylox DNA底物盒由9个独特的DNA和10个交替方向的插入loxP位点组成，在胚胎干细胞（ESCs）中靶向tdTomato荧光报告基因下游的Rosa26位点（图1）。

图1 Rosa26PolyloxExpressLocus的产生

TdTomato报告基因显示了该工程位点的mRNA表达。在Polylox DNA底物中，Cre驱动的loxP位点侧翼DNA的随机缺失或倒位导致DNA条形码的产生（图2A）。为了从单个造血细胞中识别条形码和转录组，研究人员开发了一个工作流程，从两个测序组（Illumina和SMRT）中检索细胞指数，以匹配单细胞的条形码和转录组（图2B）。为揭示HSC命运，分析出生后7-20周的小鼠，分选HSC以及谱系细胞（图2C）。分析单个HSC和祖细胞的条形码和全转录组。结果，通过单细胞RNA-seq鉴定的条形码在相同群体的分析中被发现。说明外周细胞群中条形码频率的相关模式与骨髓-红系和淋巴发育之间的分裂一致。

图2 PolyloxExpress用于单细胞分辨率下的谱系追踪和转录组谱分析

2 根据其命运定义HSC克隆

通过关注低生成概率（Pgen）的Polylox条形码来定义单个HSC克隆。在4项实验中，产生了91个HSC克隆，具有以下命运模式：（1）分化失活的HSC克隆，缺乏谱系输出；（2）HSC克隆包含在骨髓细胞和红细胞中发现的条形码，但在淋巴系中不存在或仅少量存在；（3）多系HSC克隆，其中在HSC中发现的条形码存在于所有取样的谱系中；（4）少量条形码频率较低克隆的骨髓-红系和淋巴系，未进行分类（图3A、3B）。分化失活、髓系-红系限制性、髓系-红系偏倚和多系HSC命运类型的造血产物示意图见图3C。

图3 PolyloxExpress条形码显示HSC克隆小鼠的体内命运

3 通过主成分分析（PCA）研究HSC克隆的命运和转录组

分析HSC的单细胞RNA-seq数据，进行PCA分析基因表达变异性（图4）。突出显示具有确定命运的HSC（图4A）。值得注意的是，PC2根据其命运区分条形码HSC。分化失活和多系HSC距离最大，而骨髓-红系限制性HSC位于其他两种命运类型之间（图4B）。PC2的基因负载表达分离无活性和多系HSC的基因（图4C）。相反，PC1并没有根据命运来区分HSC（图4D）。通过全转录组对HSC进行聚类，沿着PC1分离聚类（图4E），PC1由翻译相关基因定义（图4F）。这表明通过全转录组的HSC聚类并不容易发现其命运信息。

图4 主成分分析（PCA）在一个轴上按命运分离HSC克隆（PC2），在另一个轴上按命运分离整个HSC转录本（PC1）

4 HSC克隆向转录景观的投射

为了深入了解HSC和祖细胞分化，使用单细胞转录组构建的扩散图。并使用谱系特异性标记基因进行注释，显示主要分支为淋巴系与髓系、红系和巨核细胞谱系（图5B）。测量细胞在这个谱中的位置，从共同躯干的尖端HSC开始向不同类型的祖细胞（图5C）。为了在转录谱中定位HSC克隆，根据HSC克隆的命运（分化失活、髓红系限制、多系）对其进行分类。与PCA分析一致，发现属于同种命运类别的HSC在转录谱上更相似。这一发现表明，克隆中HSC的命运源于相似的转录组。在转录谱中，分化失活的HSC克隆在谱系分支中没有祖细胞（图5D）。未发现由骨髓-红系限制性HSC克隆或其他违反HSC克隆命运产生的淋巴祖细胞（图5E）。因此，祖细胞的分布与外周细胞中条形码定义的HSC克隆命运一致。

图5 将命运决定的HSC克隆投射到造血转录谱

5 多系与分化失活HSC克隆的分子标志

为了阐明分化失活和活性多系HSC之间的分子差异，解析了它们在转录谱主干中的位置（图6A）。与多系HSC克隆相比，分化失活的HSC更接近转录谱的根部（图6B）。分选的HSC包含长期（LT）（Lin-Kit+Sca1+CD150+CD48-）和短期（ST）（Lin- Kit+Sca1+CD150-CD48-）HSC群，从正常小鼠中分选的HSC进行单细胞RNA-seq。基于单细胞RNA-seq和已发表的数据分析了LT-HSC和ST-HSC特异性基因的表达。分化失活的HSC的LT基因表达特征高于具有分化活性的HSC，而具有分化活性的HSC其表达ST特征水平较高（图6C）。在细胞频率方面，分化失活的HSC富集了LT-HSCs，而多系HSC富集了ST-HSC（图6D）。然而，有多系和分化失活的HSC具有LT和ST标记。接下来，定量评价细胞周期中S期、G2期和M期中富集基因的表达。分化失活和分化活跃的多系HSC在细胞周期活性方面没有显著差异（图6E）。使用基因表达标记休眠的HSC，休眠HSC比分化失活的HSC更具有多谱系特征（图6F），这表明休眠细胞有助于分化。总之，分化失活和分化活跃的多系HSC不符合先前描述的HSC类别（LT、ST或休眠）。接下来鉴定了差异表达基因（DEGs），其在分化失活的HSC中产生了更高的表达（图6G）。检测差异基因表达的稳定性，结果显示分化失活和多系HSC可以单独通过转录组进行分离。与之前对细胞周期评价和休眠标记的观察结果一致，DEGs没有富集细胞周期调节因子（图6G）。几个DEGs表达增加（Cd34，Vim，Serpinb1a，Plac8）或减少（Apoe，Mycn，Bex1，Pdzk1ip1，Uba7，Gng11），与转录谱根部分化失活HSC的富集一致。转录因子Hoxb2在分化失活的HSC中更高表达，之前已发现在急性髓系白血病中过表达。结合这一结果和我们的数据显示Hoxb2在分化失活的HSC中优先表达，表明Hoxb2可能是HSC分化的抑制剂。

最后，寻找PCA和DEG鉴定的基因列表之间的交集。此外，信号通路的表达特征分析表明，与多系和髓红限制性HSC相比，JAK-STAT通路在分化失活HSC中的活性更高。

图6 分化失活和分化活跃多系HSC克隆的转录组特征

6 多系与限制性HSC克隆的分子特征

多系和红系限制性HSC克隆实现了不同的命运。为了深入了解转录差异，根据转录谱和分化方向，对红系限制性HSC克隆进行排序。限制性HSC在分化失活和多系HSC之间以这种时间顺序定位（图7A）。限制性和多系HSC的细胞周期评价没有差异（图7B）。考虑到每个克隆的细胞数量无显著差异，命运似乎也与克隆大小无关。基于比较CMPs和CLPs基因表达差异，寻找HSC期髓系-红系与淋巴系启动的转录证据（图7C）。与多系HSC相比，红系限制性HSC的淋巴样细胞标记减少（图7D）。在MPP阶段，与骨髓红系限制性HSC的MPPs相比，多系HSC来源的MPPs的淋巴标记更明显（图7E和7F），在细胞周期上没有发现不同（图7G）。综上所述，髓系-红系限制性克隆通过淋巴系标记的低表达来区分。通过监督分类，骨髓-红系和多系MPP之间的区分也很明显。多系和髓红系限制性HSC克隆之间的DEGs包括转录本在多系HSC中更为丰富，反之亦然（图7H）。Cd34和Serpinb1a的高表达和Mycn和Apoe的低表达区分了多系HSC与分化失活（图6G）和骨髓红系限制性HSC（图7H）。相比之下，H2afy、Tap2、Rif1和Krt18的差异表达对多系和髓红限制性HSC的区分具有特异性。编码组蛋白H2变体的H2afy基因先前涉及HSC维持和平衡输出。来自多系HSC克隆的MPP中表达上调的基因包括淋巴标记基因Flt3和Dntt（图7I）。这些数据表明LMPP来自多系HSC克隆。与这一发现一致，观察到髓红系和淋巴系发育之间的转录谱存在边界，淋巴系仅由多系克隆细胞在MPP区域杂交（图7J）。

最后，检测了髓系-红系偏倚的HSC克隆。根据所有测试的标准，具有这种命运模式的HSC转录定位在骨髓红系限制性和多系HSC之间；在转录谱上，骨髓红系HSC更接近多系HSC。

图7多系和髓红系限制性HSC克隆的转录标志

讨论

本研究使用PolyloxExpress研究小鼠单个HSC克隆的命运和转录组，发现成人造血系统保留了其在胎儿中克隆发育的功能印记。条形码和命运图显示发育的HSC克隆命运一致（分化失活，多系，髓红系限制性）。在所有分析的小鼠中，具有给定命运的HSC克隆落入转录谱的相同区域。方差分析显示每个命运类别内转录组的同质性，这为克隆一致性提供了支持。为了深入了解更多的HSC分化，分析了短寿命和系限制性祖细胞，首次揭示了生理性造血中HSC增殖和分化之间的关系。

评论

为了获得同一细胞中命运和转录组的信息，本研究开发了PolyloxExpress等位基因，将单个HSC命运与转录组联系起来，提供了识别HSC命运转录特征所需的信息。研究人员发现分化失活、多系和谱系限制性HSC克隆位于造血转录的不同区域。这些在生理条件下对命运和转录组的联合分析可能为鉴定HSC命运的分子因素铺平道路。

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