科研 | 维也纳大学：拟南芥MPK4基因在病原触发的可变剪接中的作用
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Role of MPK4 in pathogen-associated molecular pattern-triggered alternative splicing in Arabidopsis
译名：拟南芥MPK4基因在病原触发的可变剪接中的作用
期刊：PLOS Pathogens
IF：6.463
发表时间：2020.04
通讯作者：Heribert Hirt
通讯作者单位：维也纳大学
DOI号：10.1371/journal.ppat.1008401
实验设计
结果
1、病原鞭毛蛋白诱导植物506个基因可变剪接
为确定PTI信号是否与植物的可变剪接有关，本研究对flg22处理的拟南芥进行RNA-seq，与对照组进行可变剪接对比。总共获得flg22诱导506个基因的546种可变剪接（图1A），85%为内含子位点，7%为3’剪接位点，6%为5’剪接位点，6%为跨越外显子位点。这表明flg22诱导的大量基因的可变剪接。
将这506个差异剪接的基因与1950个差异表达基因进行比较，仅89个基因重叠（图1B），即使降低差异表达基因的显著水平，大部分差异表达基因仍不属于差异剪接基因。然而，GO聚类分析显示，差异剪接基因与差异表达基因的聚类有相似之处（图1 C and D）。而富集的差异之处为差异剪接基因富集于RNA代谢，以及植物防御和免疫反应。RNA代谢相关基因主要为剪接因子，包括SCL33、SR30、SR45a、RS40、RS41、U2AF65A、RZ1B、RZ1C。同时，差异剪接基因包括一些转录调控因子，如RNA结合蛋白、DNA解旋酶、转录因子。在这类基因中选择reads覆盖度明显差异的6个基因，进行半定量RT-PCR（PAGE电泳）验证（图2）。
2、MPK4是可变剪接的主要调控因子
为评估MAPK基因MPK3、MPK4、MPK6是否在PAMP触发的可变剪接中发挥作用，本研究对MAPK基因敲除突变体进行RNA-seq。结果表明没有flg22的诱导下可变剪接事件没有明显区别。然而在flg22处理后，发现mpk4突变株里的可变剪接基因明显减少（图3A）。mpk3和mpk6突变株则出现较多的差异表达基因，而差异剪接基因较少。对比flg22处理的野生型植株，mpk4突变株有344个差异剪接基因及364个不同的可变剪接事件（图3B），大部分属于内含子剪接位点，30个3’端剪接位点，28个5’端剪接位点，6个跨越外显子的剪接位点。韦恩图的分析表明，mpk4株系中的差异剪接基因与flg22诱导的野生型的差异剪接基因高度重叠（图3C），有225个核心类型的PAMP诱导的可变剪接事件在mpk3和mpk6中仍有发生，但在mpk4中缺失。这表明506个flg22诱导的可变剪接基因中，39%的基因受MPK4基因调控，而mpk4突变株有136个可变剪接基因与flg22诱导无关。在mpk4株的差异剪接基因中，只有18%的基因具有显著表达差异（图3D），证明了差异剪接事件与差异表达事件的不相关。半定量RT-PCR验证了mpk4突变株在flg22诱导下可变剪接受到影响（图4）。因此，flg22诱导可变剪接事件依赖MPK4基因。
先前研究表明SUMM2基因的功能缺失抑制植物免疫功能，SUMM2编码一种富亮氨酸蛋白质，识别病原效应物，参与MEKK1-MKK1/2-MPK4通路。因此我们额外对summ2、mpk4、mpk4+summ2突变株进行RNA-seq。summ2突变株中有93个差异表达基因，而mpk4突变株中有3542个差异表达基因，但mpk4中93%的差异表达基因在mpk4+summ2突变株中没有差异，剩233个差异表达基因。这表明SUMM2基因可保护MPK4基因的表达。mpk4株中有62个差异剪接事件，而summ2中有795个差异剪接事件，mpk4+summ2中有673个差异剪接事件。这表明SUMM2基因虽然抑制mpk4突变体的差异表达，但独立调控可变剪接。然后，本研究进行flg22诱导summ2、mpk4、mpk4+summ2突变株，对差异剪接基因进行对比（图3 E and F），结果显示mpk4与summ2几乎没有相同的剪接基因。因此SUMM2基因对flg22触发的可变剪接起次要调节作用，主要控制依赖MPK4的基因表达差异。
GO富集分析表明PAMP诱导的MPK4调控的可变剪接基因功能富集于'RNA加工和剪接’（图5）。在富集的剪接因子基因中，发现几种富丝氨酸/精氨酸（SR）的剪接因子，SR蛋白是mRNA代谢和可变剪接的重要调控因子。在富集的免疫相关基因中，发现RPP4，编码一种Toll受体结构域的富亮氨酸蛋白。此外还发现CIPK3，一种蛋白激酶，调节脱落酸和应激基因表达；WRKY26，一种转录因子，调节植物耐热性；NTH2，编码一种参与DNA修复损伤的糖基分解酶。
3、鞭毛蛋白诱导蛋白激酶基因的可变剪接
可变剪接的结果导致不同转录本亚型的相互转换，翻译出具有功能差异的蛋白质。使用reads覆盖度可定量比较转录本可变剪接的不同亚型，据此本研究筛选出68个显著的可变剪接基因，其中40个与flg22诱导有关（图6A）。GO富集分析揭示这些基因集中于蛋白激酶（图6B），可变剪接导致这些基因的激酶结构域发生变化。比如，CPK28，编码一种钙依赖性蛋白激酶，通过磷酸化BIK1（介导多模式识别受体的细胞质蛋白激酶）减弱植株PTI（图6D）；CRK13/29，编码富半胱氨酸受体激酶，由于剪接使得富丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶结构域的异构体产生（图6E）；SERK4/BKK1，富亮氨酸蛋白激酶的受体，在flg22的诱导下激酶功能结构域的亚型减少（图6C）。RT-qPCR验证了CPK28、CRK29、SERK4的剪接产生（图6 F and G）。
讨论
高等植物中，可变剪接对基因表达起关键作用，对植物的生长发育和外界胁迫响应十分重要。PAMP识别下，植物蛋白激酶通过调控防御基因来调节植物代谢，本研究发现的基因有富半胱氨酸受体激酶、WRKY转录因子、胞质醌还原酶。在flg22诱导下，MPK4基因是可变剪接发生的重要调控因子，mpk4突变株中大量的可变剪接基因发生差异。本研究发现MPK4靶点有SCL30，影响剪接因子的磷酸化；At-RS31，一种影响叶绿体通路的剪接因子；At-SR45a，一种在剪接体装配早期发挥作用的剪接因子。MPK4基因对剪接因子的剪接调控，深化了对PAMP诱导下的可变剪接的理解，这表明PAMP信号的诱导下MPK4介导的剪接因子的剪接会导致二级靶标基因的可变剪接，这可能是一种潜在的调控机制。
评论
植物mRNA的可变剪接是植物环境胁迫耐受性的重要调控机制，但具体信号诱导机制仍未知。植物的PTI（病原相关分子模式免疫反应）受丝裂原活化蛋白激酶基因MPK调控，本研究在拟南芥上发现了MPK4基因是诱导PTI可变剪接的关键调控因子。研究中鞭毛蛋白flg22诱导了植物大量产生可变剪接，共鉴定506个，其中受MPK4调控的基因有大量剪接因子基因、免疫相关基因如钙依赖性蛋白激酶CPK28、富半胱氨酸受体激酶CRK13/29。同时，MPK4调控的大量剪接因子的作用可能与病原体识别、信号转导、植物防御关键酶相关，这些剪接因子的靶标可进行深入研究。
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