科研│J AGR FOOD CHEM：转录组分析揭示高CO2处理后柿子中碳水化合物代谢对不同乙醛生产能力的影响（国人佳作）
编译：澜粒粒，编辑：景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
大多数品种的柿子果实在发育过程中可溶性单宁酸的持续积累，导致涩味。大多数商品化品种和天然种质均为涩型，因此去除可溶性单宁酸对于食用柿子非常重要。高CO2处理是最有效的去除涩味的方法。然而，高CO2处理对不同品种的影响不同。本研究通过对3种柿子“洛阳方天生柿”（LYFTSS）、“石家庄莲花柿”（SJZLHS）和“劳皮格柿”（LPG）对高CO2处理后的转录组学和代谢产物的研究，阐述了CO2驱动脱涩味的分子机制。本研究表明，乙醛和乙醇是与脱涩有关的代谢产物。基于RNA-seq数据，加权基因共表达网络分析显示，一个包含1773个基因的模块与乙醛和乙醇的含量显著相关（P <0.001）。基于乙醛代谢途径的进一步分析表明，醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶以及它们的上游成员（例如磷酸果糖激酶）与乙醛生产呈正相关。对前体物质的定量分析表明，除了苹果酸外，蔗糖，葡萄糖和果糖在品种之间表现出有限的差异。然而，苹果酸的含量远低于总可溶性糖含量。实时定量PCR和相关分析表明，属于碳水化合物代谢的基因与果实中的乙醛含量显着相关。因此，差异表达的碳水化合物代谢相关基因是不同柿子品种中乙醛生产差异的基础。
论文ID
原名：Transcriptome Analysis Revealed the Roles of Carbohydrate Metabolism on Differential Acetaldehyde Production Capacity in Persimmon Fruit in Response to High-CO2 Treatment
译名：转录组分析揭示高CO2处理后柿子中碳水化合物代谢对不同乙醛生产能力的影响
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：4.192
发表时间：2021.01
通讯作者：祝庆刚, 殷学仁
通讯作者单位：西北农林科技大学， 浙江大学
DOI号：10.1021/acs.jafc.0c06001
实验设计
结果
1 不同品种内源性乙醛和乙醇的含量
以前的研究表明，洛阳方天生柿（LYFTSS）可以轻松去除涩味，同时可溶性缩合单宁（SCT）迅速降低，而对劳皮格（LPG）和石家庄莲花柿（SJZLHS）的品种脱涩更困难，因为对高CO2处理的SCT变化有限。对乙醛以及乙醇的含量进行测定（图1），结果表明在对照（CK）果实中均未检测到乙醛和乙醇。在高CO2处理的水果中，SJZLHS和LYFTSS中的乙醇和乙醛含量高于LPG，这与不同品种之间的去涩度差异是一致的。在高CO2处理的LPG，SJZLHS和LYFTSS柿子中，乙醇含量分别为178.2、1215.0和1403.0 μg/g（图1），而仅在高CO2处理的SJZLHS和LYFTSS柿子中检测到乙醛，含量分别为87.7和67.6 μg/g（图1）。
图1. 处理过的柿子果实中内源性乙醛和乙醇的定量。用高CO2（95％）或空气（CK）处理3个品种，包括LPG，SJZLHS和LYFTSS，持续1天。N/A表示未检测出。
2 RNA-Seq和加权基因共表达网络分析
RNA测序结果表明的3个品种的差异表达基因（DEG）数分别为LYFTSS> SJZLHS> LPG（图2）。使用KEGG分析获得了三个品种中这些单基因的功能注释。通过KEGG富集分析，来自SJZLHS和LYFTSS的DEG参与了植物与病原体的相互作用，内质网中的蛋白质加工以及植物激素信号转导，而来自LPG的DEG则主要富集于糖酵解/糖异生，苯丙烷类生物合成和光合作用（图2b）。
图2.基因表达的火山图和DEGs的KEGG富集分析。（a）LPG，SJZLHS和LYFTSS基因的火山图。红色，绿色和黑色圆点分别表示基因表达上调和下调或无差异。（b）在三个柿子品种的DEGs上KEGG富集分析。
为了进一步鉴定乙醇和乙醛代谢的相关基因，对11606个基因进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），以了解相应的基因表达与生理特征之间的关系（图3a）。用相同的表达模式基因集群化到同一模块以生成聚类图（图3b），获得了20个模块，其中蓝色模块与乙醇和乙醛具有显着相关性，Pearson相关系数分别为0.98和0.95（P <0.01）（图3c）。
图3. WGCNA基于RNA-蓝色模块中有1773个候选基因，可能与乙醛和乙醇的代谢密切相关。RNA-seq数据和生理数据的样本聚类分析和共表达模块的构建。（a）基于基因表达数据和生理数据的样本树状图和性状热图。（b）基于拓扑重叠的不同基因聚类树状图，并分配模块颜色。（c）模块－样本关联，模块－样本相关性以及相应的P值。
了解这些基因的功能分布，进行了eggNOG和KEGG功能分类。eggNOG分类显示，蓝色模块中的这些基因中有38％仅与未知功能和一般功能预测相关，其余分类为翻译后修饰，转录，信号转导机制以及碳水化合物转运和代谢（图S1）。1773个基因中的440个被注释到KEGG数据库中。带注释的基因主要分布在代谢和遗传信息处理中。碳代谢，植物激素信号转导和糖酵解是代谢分类中最重要的三个途径（图S2）。为了验证RNA-seq数据的准确性和可重复性，选择了八个基因进行qRT-PCR检查。qRT-PCR结果与三个柿子品种的RNA-seq数据高度相关（图S3）。
3 柿子果实中糖代谢相关基因对高CO2的差异响应
由于高CO2处理对柿果去涩作用中糖代谢的重要作用，在蓝色模块中鉴定出与乙醛和乙醇合成有关的34个基因。LPG，SJZLHS和LYFTSS的34个基因的倍数变化（CK VS CO2）结果显示LPG中这些基因的上调相对低于其他两个品种（图4 a-c）。尤其是磷酸果糖激酶PFK，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（DkPEPC1），磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶（DkPEPCK1），丙酮酸激酶（PK，DkPK1），丙酮酸脱羧酶（PDC）和醇脱氢酶（ADH），在SJZLHS和LYFTSS中显著被诱导，表明这些基因可能是柿子酒精发酵过程中的关键结构基因。
图4. 三个柿子品种的碳水化合物代谢曲线。（a–c）LPG，SJZLHS和LYFTSS中碳代谢相关基因的倍数变化（CO2 vs CK）。（d–g）响应高CO2处理，三个柿子品种中蔗糖，葡萄糖，果糖和苹果酸含量的变化。（* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001）。N/A表示未检测。
由于响应高CO2的不同品种乙醛生产的显着差异，因此对上游底物（例如蔗糖，葡萄糖，果糖和苹果酸）进行了定量。只有苹果酸在三个品种中表现出与乙醛产量的伴随差异，LPG果实中的苹果酸仍未检出，而SJZLHS（1.7 mg/g）和LYFTSS（1.3 mg/g）中的苹果酸含量更高。经过高CO2处理后，三个品种的苹果酸含量均检测不到（图4g）。但是，绝对值的比较表明，苹果酸的价值远远低于三种可溶性糖的价值。因此，综上所述，底物定量和RNA-seq结果表明，在高CO2处理下，LPG果实中乙醛的缺乏很可能是由于多个生物合成基因的低丰度所致。
4 不同品种候选基因与乙醛产生的相关性
由于转录组分析的品种有限，因此选择了14种涩型柿子以进一步分析与乙醛合成有关的关键基因。九个结构基因，包括EVM0002315（PFK，EVM0002315和EVM0006659被证明是相同的基因），EVM0008535（DkPK1），EVM0030653（DkPK7），EVM0023314（DK PEPC1），EVM0005033（DK PEPCK1），EVM0027273（DkPDC1），EVM0022732 （DkPDC2），EVM0007501（DkADH1）和EVM0027066（Dk ADH4），显示了不同品种对高CO2处理的不同反应（图5a）。不同品种乙醛含量在30.4至255.5μg/g之间（图5b）。然乙醛含量与基因表达之间的相关系数如图5所示。在这些基因中，EVM0002315（PFK）与乙醛浓度显着相关（P <0.05），R 2为0.75（图5d）。
图5.乙醛代谢相关基因的表达量与乙醛含量之间的相关性。（a）14个柿子品种中与乙醛代谢相关的9个基因的表达的热图。CK，对照组24小时的果实；CO2，高CO2（95％CO2，4％N2，1％ O2; 24小时）处理的果实。（b）在高CO2处理下14个柿子品种的乙醛生产。LPG，SJZLHS和LYFTSS中的乙醛含量如图1所示。（c）乙醛生产与基因表达之间的回归系数。（d）基因表达的线性回归（EVM0002315，DkPFK）和17个品种的乙醛含量。
讨论
柿子中积累的SCT含量高，导致大多数品种的果实涩味，影响柿子的经济价值，去涩处理对于柿子产业是必不可少的。通过触发乙醛生成和SCT聚合，高浓度的CO2处理被证明是最有效的柿子涩味去除方法。在之前的研究中，关键结构基因（例如DkADH1，DkPDC1/2）和转录因子（主要是DkERF，DkWRKY和DkMYB）被确定与高CO2驱动的去涩作用有关。在高CO2处理下，转录因子DkERF8 / 16 / 19 / 24，DkWRKY1和DkMYB6/10的表达显著上调。其中，DkERF8 / 16 / 19 / 24表现出的亲和力和直接与脱涩相关基因的启动子，而DkMYB6/10和DkWRKY1通过转录调控DkERF9 / 19启动子或形成和DkERF24的转录因子复合物产生间接影响。这些结果揭示了高CO2处理下柿子去涩的分子机制。然而，不同品种间柿子去涩力的差异，如去涩率和去涩度等，已被广泛报道，但相关机制的研究甚少。
三个品种柿子的乙醛和乙醇含量测定结果表明，LPG中的乙醛和乙醇比SJZLHS和LYTFSS中的低得多（图1）。尤其在处理后具有高SCT的LPG中，乙醛仍未检出，进一步证明乙醛是柿子果实去涩性的重要代谢产物。KEGG通路分析表明，来自LPG的DEGs主要富集在糖酵解/糖异生中，表明LPG中的糖主要转化为其他厌氧代谢中间体，但不转化为乙醛，这可能是LPG涩的原因。
在大多数情况下，脱涩过程是由乙醛和SCT共同引起的。然而，SJZLHS的涩味表明乙醛含量可能不能完全解释柿子果实在高CO2下的涩味。这些结果为理解乙醛与SCT之间的关系提供了的材料。除了乙醛的含量外，乙醛与SCT的结合可能还需要一些其他生理条件。
糖和有机酸是植物厌氧发酵的常见底物。在LPG中，苹果酸也保持不可检测状态（图4g），这与乙醛的产生相似。LPG中苹果酸的极低含量可能是乙醛产量降低和LPG去涩困难的原因之一。
三个柿子品种中可溶性糖的含量远高于苹果酸，蔗糖被认为是呼吸的碳源，充足的糖分供应对植物耐缺氧性至关重要。因此，苹果酸的差异不能完全解释乙醛的产生。根据RNA序列分析，可以找到多个结构基因，例如PFK（EVM0002315和EVM0006659），DkPK1和DkPK7（EVM0008535和EVM0030653），PEPCK（EVM0023314和EVM0005033），DkPDC1/2（EVM0027273和EVM0022732），DkADH1（1），和一个新的ADH基因（EVM0027066）在LPG中对高CO2处理的响应比在SJZLHS和LYTFSS中相对较弱（图4）。其中，ADH和PDC 被认为是调节柿子采后去涩性的主要候选药物。糖酵解中的关键酶（PK）参与了非涩柿子果实的自然脱涩过程。但是，很少研究某些其他基因（例如PFK）在乙醛生产和柿子去涩中的潜在作用。PFK是糖酵解的限速酶，已在癌症中得到广泛研究，但仅在拟南芥，水稻和梨等少数植物中具有特征，其中PFK在低氧刺激下在不同物种的不同组织中大量表达。这种差异是通过控制通过PFK的碳通量来限制耐缺氧品种的酒精发酵而实现的。为了进一步验证与碳水化合物代谢相关的基因和乙醛的产生，另外选择的14个品种的乙醛含量与基因表达之间的相关性分析结果显示DkPFK（EVM0002315）与乙醛含量的相关性最高（R2=0.75）（图5）。因此，PFK可能是控制柿子去涩性的决定性基因。
更多推荐
1 科研│J AGR FOOD CHEM（一区）：代谢物和转录图谱分析揭示了“紫娟”茶树花青素代谢的分子机制（国人佳作）
END