科研 | Front. Microbiol.：农业土壤中亚硝酸氧化菌活性和群落的响应强于它们的丰度
编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。
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自养的硝化作用受氨氧化细菌（AOB）或者氨氧化古菌（AOA）以及亚硝酸根氧化细菌（NOB）的调节。大量的研究探究了氮肥对AOA和AOB动态和多样性的影响，然而很少有研究报道NOB活性，丰度以及多样性对氮肥添加响应。本研究调查了有机和无机N肥添加对玉米田间样方中土壤NOB的影响，即施加极不相同的N处理：对照（不添加N），硫酸铵（AS100和200 kg N ha-1），以及堆肥（200 kg N ha-1）。使用通用标记物（16S rRNA 基因），功能基因标记物（AOBamoA 和Nitrospira nxrB）以及宏基因组测定硝化群落。总而言之，第一年肥料添加没有改变硝化群落，但是在4年重复的铵态氮的肥料添加下发生了显著的改变。在农业土壤中NOB中最占优势的群落是Nitrospira（>99.7%）。4年重复添加的铵态氮的肥料显著改变了AOB和Nitrospira群落，但是堆肥对其没有显著的影响。所有的硝化菌，包括comammox，在土壤宏基因组中都重新发现，但是它们的序列数非常低。尽管N处理对Nitrospira nxrB的丰度没有显著的影响，但是铵态氮肥料显著促进了潜在的亚硝酸根氧化速率（在0.15mM的亚硝酸盐土壤溶液中测定的）。理解氨氧化和亚硝根氧化对N肥添加的响应，在农业生态系统中会促进或者提高硝酸根产生对潜在环境影响的调节。
论文ID
原名：Nitrite Oxidizer Activity and Community Are More Responsive Than Their Abundance to Ammonium-Based Fertilizer in an Agricultural Soil
译名：农业土壤中亚硝酸氧化菌活性和群落的响应强于它们的丰度
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.235
发表时间：2020.08
通信作者：Jeanette M. Norton
通信作者单位：犹他州立大学
实验设计
关于本研究的试验设计，处理，土壤取样以及土壤特征在之前的研究中有详细的描述（Ouyang et al., 2016，2017）。土壤pH大约是8。试验是一个随机的完全区组的设计，包括4个区组和4个N处理：对照（不添加N肥），硫酸铵（AS 100和200 kg N ha-1）和牛粪堆肥（200 kg 总N ha-1）。处理在每年的5月份进行土壤表面施肥，在施肥之后通过立即耕作进行土壤和肥料的融合。在2天内进行玉米的种植，灌溉方法采用该区域通用的农业方法。
本研究对2015年采集的土壤样品进行了亚硝酸根氧化潜势的（PNO）的测定。PNO的测定是根据Wertz 等（2007）改良的方法。3g鲜土样品置于100 ml的锥形烧瓶中，然后添加30ml的NaNO2溶液（终极浓度为0.15mM NaNO2）。预实验在一定范围的亚硝酸根浓度下测定了PNO，结果表明没有亚硝酸根的抑制作用并且在0.15mM的亚硝酸根浓度下历经24h后有足够的亚硝酸根剩下。烧瓶上覆盖有小孔的箔纸，在30°C下振荡培养24小时（200 rpm）。在培养的1,6,20和24h后，各取1.5ml的样品，离心5分钟，然后转移到新的管子中，使用分光光度法进行浓度的测定。亚硝酸根的变化用来计算24h期间亚硝酸根的线性消耗速率。
使用试剂盒进行土壤DNA的提取。对Nitrospira nxrB基因进行定量PCR，使用的引物是nxrB169R和nxrB638F。对2014年6月份采集的土壤样品进行细菌amoA和Nitrospira nxrB基因的测序分析。测定AOB amoA基因多样性使用的引物是amoA1F/2R，测定Nitrospira nxrB基因多样性的引物是nxrB169R和nxrB638F。
使用16S 高通量测序进行硝化菌群落的确定。土壤硝化群落，包括AOA，AOB和NOB，使用16S rRNA基因序列进行评估。AOA，AOB，NOB的相对丰度以及他们特定的OTUs，即通过分割每个样本总的16S rRNA序列进行计算。NOB具有代表性的OTU选择出来创建系统发育树。
使用两因素的方差分析统计分析N处理和年对AOA，AOB，NOB和选择的OTU相对丰度的影响。处理和年作为固定效应，区组作为随机效应。单因素的方差分析用于分析N处理对amoA和nxrB靠前的20个OTU的相对丰度的影响。为了满足数据的正态性，必要时会对数据进行对数转化。对2015年采集的土壤样品，使用重复测量的方差分析，分析处理对nxrB拷贝数和PNO速率的影响。通过所有来自于硝化群落的OTUs的相对丰度进行Bray-Curtis距离矩阵的创建。分别对AOB amoA和Nitrospira nxrB库进行标准化，然后进行beta多样性的分析。稀释曲线表明标准化的读数足够获得amoA和nxrB的多样性。使用R软件中的vegan包进行非度量的多维坐标分析（NMDS）和多元置换方差分析（PerMANOVA），用于可视化和评估Bray-Curtis距离矩阵。
结果
PNO速率范围从4到20 mg N kg-1d-1。重复测量的方差分析表明处理和取样时间显著影响PNO速率，并且存在处理和取样时间的交互效应。在AS处理中，PNO速率相对于对照显著增加，但是不受堆肥处理的影响（图1A）。在施肥之前土壤样品中的PNO速率最低。此外，PNO速率在施肥处理14天后的土壤样品中的高于其它取样时间中的。Nitrospira nxrB拷贝数在每克干土中的范围是7.94╳106 到2.95╳107，没有呈现处理效应，但是有显著的时间效应。Nitrospira nxrB在所有的N处理中在施肥的第7天拷贝数最多（图1B）。Nitrospira nxrB拷贝数与PNO速率不存在显著的相关关系。
通过筛选2011年8月和2014年6月样本的AOA、AOB和NOB的16S rRNA基因序列，研究了硝化群落的结构。本研究获得的AOA、AOB和NOB的序列分别是30405，11181和19236，特定的OTUs分别是19，8和22。通过该方法本研究仅仅获得了一种OTU，属于Nitrobacter。Nitrobacter是占优势的亚硝酸根氧化菌（>99.7%）在所有的土壤样品中都恢复。土壤硝化菌对于总的原核生物群落呈现了3-5%。在2011年N处理没有改变土壤中硝化菌的相对丰度，但是在2014年，AS处理显著增加了它们的丰度，堆肥处理显著降低了其丰度（图2A）。具体而言，在2014年，AS处理显著增加了AOB的占比，堆肥处理显著减少了AOA的占比，但是NOB的占比不受N处理的影响（图2A）。
硝化菌群落结构在2011和2014年中不相同，并且在2014年N处理显著改变了硝化菌的群落（图2B）。Two-wayPerMANOVA确定了硝化菌群落组成受年，处理和它们交互作用的显著影响。在总的原核生物群落中相对丰度高于0.1%的选择了7种OTUs进行了详细的统计分析。在2011年7种OTUs中没有一种呈现N处理效应。在2014年AOB OTU23（与Nitrosospira multiformis有关）的相对丰度在AS处理中显著增加。三种选择的AOA OTUs，属于Nitrososphaer cluster，在2014年的堆肥处理中降低。Nitrospira OTU_13和OTU_276属于Lineage II，但是OTU_202属于Lineage V。在2014年，Nitrospira OTU_13的相对丰度在所有的N肥处理中降低，AS处理使OTU_202增加，然而堆肥处理使OTU_276增加。
AOB和Nitrospira群落结构也分别使用amoA和nxrB基因的高通量测序分析进行评估。AOB和Nitrospira分别获得22980和27061条高质量的原始序列，分别获得44个和70个独特的OTUs。其中有一个样本，由于低读数（<150）从对照处理中移除。
AOB群落结构受N处理的显著影响。成对比较分析表明对照和堆肥处理之间没有差异。然而，AS处理与对照和堆肥处理中的显著不同（图3A）。前20个占优势的OTUs的系统发育分析表明这些占优势的OTUs都属于Nitrosospira Cluster 3谱系（图4）。N处理显著改变了9种占优势的OTUs。值得注意的是，AOB1（与Nitrosospira multifomis ATCC 25196紧密相关）在N肥的处理中显著高于对照处理中的（图6A）。AOB6，AOB12，AOB16以及AOB17，与Nitrosospira sp. Wyke8紧密相关，在对照和施肥处理中的显著高于AS处理中的。Nitrospira群落结构也受N处理的显著影响。类似地，成对比较分析表明对照和堆肥处理之间没有显著差异。
Nitrospira群落结构也受N处理的显著影响。类似地，成对比较分析表明对照和堆肥处理之间没有差异。然而，AS处理中的与对照和堆肥处理中的都显著不同（图3B）。系统发育分析表明这些前20个占优势的OTUs隶属于至少5种不同的Nitrospira谱系（图5）。N处理显著改变了8种占优势的OTUs（图6B）。例如，在堆肥处理中，nxrB16（谱系V）显著高于对照处理中的，然而nxrB2，nxrB4，nxrB43和nxrB14都显著高于对照处理中的，然而nxrB1，nxrB3和nxrB16显著低于对照处理中的。
通过基因靶向组装，筛选出的5个硝化基因均在土壤转化基因组中获得。AOA有6种OTUs，属于Nitrososphaera和Nitrosocosmicus。AOB有7种OTUs，大多数与Nitrosospira紧密相关。AS处理相对于对照和堆肥处理有相对较高的AOB丰度。
讨论
1 基于铵态氮的肥料添加改变了Nitrospira的活性和群落组成而不是丰度
氨的氧化通常被认为是硝化过程的限速步骤。最近的研究也表明PNO比潜在的氨氧化更高（Ke et al., 2013）。然而，相对于硝化潜势（NP），PNO速率在同样的土壤样品中相对于NPs较低（Ouyang et al., 2017）。对于2015年8月采集的土壤样品，本研究在进行NP试验期间也测定了亚硝酸盐的动态。结果表明亚硝酸盐的积累在24小时的震荡期间是线性积累的，从6%增长到43%。总而言之，观测的试验结果表明在没有有效铵的限制以及连续震荡时，在NP试验过程中亚硝酸根的氧化是限速步骤。值得注意的是，在NP试验期间亚硝根的积累或许不能代表野外条件。在野外生长季节的大部分时间里，土壤铵的有效性是受到限制的，从而导致氨氧化速率受到土壤基质中细胞表面扩散的限制（Stark and Firestone, 1995）。
本研究发现基于铵态氮的肥料添加而不是堆肥的添加PNO是增加的。可能会刺激亚硝酸根氧化酶的产生。基于铵态氮的肥料添加会导致短期亚硝酸根含量的提高（来自于氨的氧化）。然而，铵态氮的肥料和堆肥没有改变nxrB拷贝数。其中一种理由可能是Nitrospira基因组中含有多种nxrB基因拷贝数，在现如今的Nitrospira基因组中有2到6个拷贝数（Pester etal., 2014）。因此，nxrB拷贝数既没有反应Nitrospira丰度也没有反应实际酶的变化。在本研究中，PNO与nxrB基因拷贝数不相关。之前的一些研究报道了PNO与Nitrobacter-like NOB有显著的强相关性，但是与Nitrospira-like NOB有较弱的相关性（Attard et al., 2010; Han et al., 2018）。在本研究中尽管Nitrobacter在16S和宏基因组分析中出现了，但是它们的丰度相对于Nitrospira极低。在本研究的土壤中后续会使用qPCR和高通量扩增测序进一步测定Nitrobacter对亚硝酸根氧化的贡献。
基于Nitrospira nxrB的高通量测序分析，基于铵盐的肥料添加而不是有机肥料的添加显著改变了Nitrospira的群落组成。然而，Han 等（2018）的研究结果表明无机或者有机肥料添加显著改变了Nitrospira的群落组成。粪肥，比本研究中使用的堆肥有相对更高的有效N，在他们的研究中已经连续施肥26年。如果再过几十年本研究也可能观测到类似的效应。有趣的是，在OTU水平，有机和无机N肥添加增加或者减少优势OTUs。格局与每个特定的谱系相对一致。Nitrospira OTUs对N肥响应多变的格局表明Nitrospira群落生理结构的多样性。
2 土壤硝化菌分子技术的比较
靶向16S rRNA基因测序分析在本研究早期研究中提供了amoA基因焦磷酸的可比序列读数（Ouyang et al., 2016），表明16S rRNA基因的高通量测序足够强大以致于能检测硝化群落，即使它们在总的微生物群落中仅仅只占很小的一部分（2-5%）。因此，当有很高的测序深度时，可以使用16S rRNA基因的通用引物检测硝化群落。然而，值得注意的是对于一些关系近的硝化菌，16S rRNA基因的系统发育分辨率较低。例如，AOB amoA的系统发育分析表明来自于Nitrosospir有20或者44种不同的OTUs，然而16S rRNA基因呈现了仅仅一种AOB OTU属于Nitrosospir。比较amoA基因和16S rRNA基因发现，在16S rRNA基因序列中Nitrosospira multiformis ATCC 25196和Nitrosospira multiformis 24-C呈现97%的相似性，但是在amoA基因分析中大约只有88%的相似性（Norton et al., 2002）。16S rRNA基因的高通量测序使我们能够研究AOA、AOB、NOB相对频率的变化。与我们之前的研究工作一致，在4年的重复施铵态氮的肥料的处理中AOB比AOA的响应更大。
此外，有趣的是在堆肥处理中观测到了AOA相对丰度的减少，这可能是由于微生物群落其它成员的增加，例如proteobacteria（Ouyang andNorton, 2020）。不同引物的amoA通常会用来检验氨氧化菌的丰度和多样性。与我们之前的研究相比，我们用更常用的引物（amoA1F/2R）对AOB-amoA的多样性进行研究，得到了相似的群落水平和物种水平的结果（Ouyang et al., 2016）。具体而言，铵态氮的肥料显著改变了AOB群落。AS处理减少了一些与Nitrosospirasp. Wyke8有紧密联系的一些OTUs，表明与之前发现的一样高铵根含量会抑制这一类群（Webster et al., 2005）。本研究表明引物的选择对AOB群落有相对有限的影响。
鸟枪宏基因组之前研究了土壤硝化菌的多样性。然而，这个方法对于感兴趣的低丰度的基因的检测是有限的，例如在复杂的土壤样品中涉及到硝化作用的基因。在本研究中，在宏基因组的分析中仅仅2-8个硝化菌的OTUs有相对高的测序深度（>33Gb）。在每个OTU中几乎没有数，使用这种方法不能评估相对丰度。但是土壤宏基因组可能为发现新的生物体和功能提供重要的数据。例如，与comammox和Nitrobacter相关的序列发现的很少，但是这些信息确认了这两类硝化菌的存在并且促进了它们进一步的详细检测。
结论
本研究使用amoA基因标记物的硝化菌群落的调查研究补充了之前使用16S rRNA基因标记物的报道，表明4年重复N肥添加而不是一次N肥添加显著改变了硝化群落的相对丰度和组成。无机N肥强烈刺激了潜在的亚硝酸根氧化速率。N肥，不管是无机的或者是有机的，对Nitrospira的nxrB丰度没有影响，尽管nxrB的丰度呈现显著的时间变化。16S rRNA测序发现Nitrospira在亚硝酸根氧化菌中占优势。铵态氮的肥料添加显著改变了基于nxrB基因的Nitrospira群落组成。
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