科研 | Hepatology：小鼠肝硬化相关神经炎症依赖于肠道菌群作用并可通过粪菌移植缓解
编译：莫沉，编辑：十九、江舜尧。
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研究报道显示，肝硬化和肝性脑病(hepatic encephalopathy, HE)与肝-肠-脑轴改变有关。尽管有研究发现，在抗生素处理之后进行粪菌移植(Fecal microbial transplant, FMT)可以一定程度上改善肝性脑病，然而其对大脑功能的影响尚不清楚。本研究旨在探讨通过人源菌群供体移植在无菌小鼠(germ-free, GF)上对其肝-肠-脑轴的影响。实验通过四氯化碳在GF小鼠和正常小鼠中诱导肝硬化模型，并与GF小鼠和正常对照组进行比较。另外，分别移植来自健康对照组(Ctrl-Hum)和肝硬化患者(Cirr-Hum)的粪便菌群到GF小鼠中。合并使用抗生素后肝硬化患者的粪便(pre-FMT)样本以及同样的患者在接受健康供者移植15天后(post-FMT)的粪便样本。分别利用pre-FMT和post-FMT的样品制备无菌上清液，用粪便或者无菌上清液对GF小鼠进行体内定植实验。收集全部小鼠的额叶皮层，肝脏，小肠及大肠组织，分别进行皮质炎症、突触可塑性和g-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)信号转导、肝脏炎症和肠道菌群16s多样性测序。研究发现，与Ctrl-Hum组小鼠相比，Cirr-Hum组小鼠有更为明显的神经炎症、小胶质细胞/胶质激活、GABA信号传导和更低的突触可塑性，上述变化与菌群失调有关，但没有改变肝脏组织病理变化。Pre-FMT的移植与神经炎症，小胶质激活及菌群失调有关，而上述指标在post-FMT移植中显著降低。移植pre-FMT和post-FMT的样品制备无菌上清液对脑功能的各项指标均没有影响，肝脏炎症未受影响。综上所述，与健康人相比，肝硬化患者的菌群移植可诱发更高程度的神经炎症及神经元的活化。
论文ID
原名：Neuroinflammation in Murine Cirrhosis Is Dependent on the Gut Microbiome and Is Attenuated by Fecal Transplant
译名：小鼠肝硬化相关神经炎症依赖于肠道菌群作用并可通过粪菌移植缓解
期刊：Hepatology
IF：14.971
发表时间：2019年6月
通信作者：Jasmohan S. Bajaj, M.D
通信作者单位：弗吉尼亚联邦大学麦圭尔医学中心，消化内科，肝病和营养学系
实验设计
本研究实验设计如下：A. 菌群定植实验设计. B. 粪菌移植实验设计. 其中，Cirr-Hum：移植有轻微肝性脑病的肝硬化患者菌群；Ctrl-Hum：移植健康对照者的菌群。
图1. 实验研究设计流程图
结果
1 不同的菌群移植导致无菌小鼠皮质炎症
与健康对照组小鼠及无菌对照小鼠相比较，肝硬化小鼠IL-1β和MCP1表达水平显著升高。同时，无菌肝硬化小鼠GFAP, IL-1β, MCP1的表达水平显著高于无菌对照组小鼠。尽管无菌小鼠中NeuN/Fox3的表达水平没有明显差异，肝硬化模型小鼠中NeuN/Fox3的表达水平则显著升高。此外，与其他各组相比，接受健康对照菌群移植的小鼠BDNF的表达有所升高。与无菌小鼠相比，正常对照小鼠GABRAB1 和 GABRAG1的表达水平较高。
图2小鼠额叶皮层的mRNA表达水平变化。A. 实验各组小鼠IL-1b 表达水平变化. B. 实验各组小鼠MCP1表达水平变化. C. 实验各组小鼠IBA1表达水平变化. D. 实验各组小鼠GFAP表达水平变化. E. 实验各组小鼠NeuN/Fox3 表达水平变化. F. 实验各组小鼠BDNF表达水平变化. G. 实验各组小鼠GABRAB1 表达水平变化. H. 实验各组小鼠GABRAG1表达水平变化. 其中，Cirr-Hum：移植轻微肝性脑病的肝硬化患者菌群；Conv cirr: 四氯化碳诱导肝硬化模型小鼠；Conv ctrl: 正常对照组；GF cirr: 无菌小鼠诱导肝硬化条件下移植健康对照菌群；GF ctrl: 无菌小鼠对照组.
2 肝硬化小鼠及菌群移植肝硬化患者小鼠菌群的差异分析
与正常对照组相比，肝硬化小鼠中Staphylococcaceae, Streptococcaceae,以及 Enterobacteriaceae的相对丰度显著升高，这使得肠道中Bifidobacteriaceae 及Lachnospiraceae等有益菌的丰度有所降低（表1）。在菌株水平上，与肝硬化小鼠相比，正常小鼠大肠中Akkermansia muciniphila, Lactobacillus reuteri, Ruminococcus torques and Ruminococcus bromii的相对丰度相对较高，同时Shigella 和Klebsiella spp.的丰度相对较低（图3A）。同样地，与肝硬化小鼠相比，正常小鼠小肠中隶属于Lactobacillaceae和Lachnospiraceae的丰度较高，而隶属于Porphyromonadaceae和Staphylococcaceae的丰度则较低（图3B）。
研究者发现，与移植肝硬化患者菌群的小鼠相比较，化学诱导肝硬化模型小鼠其Enterobacteriaceae, Streptococcaceae, Porphyromonadaceae的丰度较高，同时Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, and Bifidobacteriaceae的丰度较低，这一结果在菌株水平上的分析中也有所体现，例如，移植肝硬化患者菌群的小鼠与诱导型肝硬化小鼠相比，其Ruminococcaceae(Butyricicoccus and Ruminococcus) 以及Lachnospiraceae (Clostridial spp. and Blautia)的丰度较高，同时Klebsiella oxytoca 和 Prevotella copri的丰度较低（图3C,D）。此外，移植健康对照与移植肝硬化患者菌群的小鼠肠道菌群差异主要集中在较高的Bifidobacteriaceae和Streptococcaceae丰度，以及较低的Enterococcaceae和其他Firmicutes家族的丰度（图3E,F）。
表1 基于科水平的LefSe菌群差异分析
图3 菌种水平上的线性判别分析比较分析. x轴表示比较的两组之间的差异. A. 肝硬化小鼠(红色)与正常对照组(绿色)大肠粘膜菌群的比较分析. B. 肝硬化小鼠(红色)与正常对照组(绿色)小肠粘膜菌群的比较分析. C. 肝硬化小鼠(绿色)与移植肝硬化合并肝性脑病患者(Cirr-Hum, 红色)小鼠大肠粘膜菌群分析. D. 肝硬化小鼠(绿色)与移植肝硬化合并肝性脑病患者(Cirr-Hum, 红色)小鼠小肠粘膜菌群分析. E. 移植肝硬化患者(Cirr-Hum, 红色)与移植健康对照菌群小鼠(Ctrl-Hum, 绿色)大肠粘膜菌群分析. F. 移植肝硬化患者(Cirr-Hum, 红色)与移植健康对照菌群小鼠(Ctrl-Hum, 绿色)小肠粘膜菌群分析.
3 无菌小鼠移植不同来源菌群前后大脑功能的差异变化
与无菌小鼠无论移植pre-FMT 或者post-FMT 状态下患者的无菌上清相比较，移植粪便菌群的小鼠IL-1β，MCP1，IBA，GABRAB1 和GABRAG1的表达水平较高(图. 4A-D,G-H)。此外，在实验所有的假设条件下，移植无菌上清的小鼠其表型与无菌对照组小鼠均类似。与移植pre-FMT粪菌相比较，移植post-FMT粪菌小鼠的IBA 和IL-1β表达较低(图. 4A,C)。无菌移植的是pre-FMT 或者 post-FMT的粪菌，其GABRAG1和GABRAB1的表达均较高(图. 4G,H)。然而，GFAP, NeuN/Fox3, 以及BDNF的表达水平均无显著差异(图. 4D-F)。
图4 菌群移植后小鼠额叶皮层的mRNA表达水平变化。A. 实验各组小鼠IL-1b 表达水平变化. B. 实验各组小鼠MCP1表达水平变化. C. 实验各组小鼠IBA1表达水平变化. D. 实验各组小鼠GFAP表达水平变化. E. 实验各组小鼠NeuN/Fox3 表达水平变化. F. 实验各组小鼠BDNF表达水平变化. G. 实验各组小鼠GABRAB1 表达水平变化. H. 实验各组小鼠GABRAG1表达水平变化. 其中，GF ctrl: 无菌小鼠对照组; post-FMT all: 混合粪便样本来自移植健康对照前后的相同患者; post-FMT sup: 来自post-FMT all组粪便的无菌上清液; pre-FMT all:来自肝硬化患者抗生素处理后的混合粪便样本; pre-FMT sup: 来自post-FMT all组粪便的无菌上清液.
4移植不同来源菌群前后小鼠肠道的菌群差异分析
实验发现，移植pre-FMT及相同患者在post-FMT之后的粪菌，对小鼠的肠道菌群影响具有显著差异。与移植pre-FMT患者的粪菌相比，移植post-FMT患者的粪菌小鼠肠道中Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Lactobacillaceae以及Enterobacteriaceae的丰度显著升高，同时Enterococcaceae 和Streptococcaceae的相对丰度则显著降低（表2）。在菌株水平上，pre-FMT 供体患者肠道中具有较高丰度的Shigella boydii, Streptococcus spp., Lachnospiraceae (Lactonifactor和Dorea)以及Bifidobacteria (Bifidobacterium animalis和Bifidobacterium adolescentis)。经过移植健康对照菌群之后，富含Ruminococcaceae和Lachnospiraceae的菌群移植到患者体内，使得隶属于Lachnospiraceae(Blautia and Clostridial spp.), Bifidobacteria (Bifidobacterium pseudolongum), K. oxytoca, Bacteroides eggerthii, 以及 L. reuteri的相对丰度显著升高(图. 5A)。随后，将上述粪菌移植给小鼠，反应在小鼠小肠菌群的变化要由于大肠菌群变化，可观察到Lachnospiraceae, Enterobacteriaceae, 以及Bacteroidaceae的丰度显著升高（表2），而进一步在菌株水平上也具有上述类似的趋势(图. 5B,C)，例如Clostridial spp的相对丰度显著升高。
表2 Pre-FMT和Post-FMT基于科水平上的lefSe 差异比较分析
图5 菌种水平上进行LEfSe 比较分析. x轴表示比较的两组之间的差异. A. 移植前供体患者菌群（红色）和移植后患者供体菌群（绿色）的比较分析. B. 移植pre-FMT患者菌群的小鼠大肠菌群（绿色）和移植post-FMT患者菌群的小鼠大肠菌群（红色）的比较分析. C. 移植pre-FMT患者菌群的小鼠小肠菌群（绿色）和移植post-FMT患者菌群的小鼠小肠菌群（红色）的比较分析.
结论
该研究表明，分别移植健康对照组与肝硬化患者的菌群在无菌小鼠上的定殖具有差异，并且这一差异与脑部炎症表达的变化有关。与接受粪菌移植成功后的小鼠相比，使用抗生素处理后，移植肝性脑病患者粪便的无菌小鼠具有更严重的脑部炎症。然而，在使用无菌上清液灌胃移植时，未见移植后脑部炎症具有相同程度变化，该结果说明可能是由于移植的菌群介导了小鼠的脑部神经炎症。此外，研究还发现小鼠的脑部对与肠道菌群组成相关的炎症、小胶质细胞，胶质细胞和神经元的激活以及GABA信号通路较为敏感，这种多模态变化已被证明可能会影响人类和动物肝硬化模型中肝性脑病的相关发病机制。在本研究中，研究者发现在无菌小鼠中移植肝硬化患者的菌群可诱发皮质神经炎症和小胶质细胞和胶质细胞活化，该变化与传统化学诱导的肝硬化模型小鼠表型相似。此外，上述小鼠的脑部功能的变化比移植健康对照的菌群明显加重，这可能不仅仅是将菌群移植到无菌小鼠体内的非特异性结果。与post-FMT移植组小鼠相比，给予pre-FMT菌群移植的小鼠其大脑皮质炎症和小胶质细胞活化表达明显增加，这一变化与人类肝硬化病程发展相似，通常肝性脑病在伴随着炎症、感染和抗生素的使用而更加恶化。
上述研究表明，不同来源的人体肠道菌群定植可能导致不同程度的肝硬化小鼠的神经炎症和GABA通路及神经元的活化。与移植肝硬化患者菌群所引起的神经炎症相比，肝硬化相关的神经炎症更为严重。然而，通过对正常无菌小鼠进行post-FMT移植可降低相关神经炎症，这一结果说明肠道菌群可能在该过程中发挥直接作用而不受肝脏炎症或损伤的影响。此外，通过本研究筛选得到的与改善神经炎症相关的菌属包括Lachnospiraceae以及Ruminococcaceae，该结果也为今后在人体菌群相关移植研究中筛选合适的供体提供重要参考。
评论
肝硬化患者常伴随着受损的肠-肝-脑轴进而影响疾病的发生和发展。患有肝性脑病的患者往往反复发作，可导致累积性变化，导致大脑持续性认知障碍。目前，临床上针对这一疾病的标准治疗，包括利福昔明或乳果糖，然而往往不能有效缓解上述症状。一般来说，肝性脑病的病理生理学是多因素的，包括高血氨症、神经炎症、系统性全身炎症、胆汁酸代谢变化以及GABA信号通路的传导。在四氯化碳诱导的啮齿动物肝硬化的模型中，无菌小鼠中并不存在类似正常小鼠的肝硬化相关神经炎症的症状，上述现象提示我们可能与肠道菌群的参与有关。目前尚不清楚由菌群定植引起的肠-肝-脑轴的特定变化，基于此的研究可以为了解在没有肝硬化的情况下，肠道菌群对大脑神经炎症的作用提供了独特的视角。
此前的研究已经证明，特定的干预措施，如菌群移植，可能在复发性肝性脑病中改善大脑功能及肠-肝-脑轴的其他变化。此外，对肝硬化以外疾病的菌群移植研究也表明，无菌上清液也可能存在有益的临床效果。然而，与无菌上清液相比，肠道菌群对肝硬化患者脑功能的影响尚不清楚。基于此，在本研究中，研究者旨在通过移植肝硬化患者与健康对照组来源的菌群对无菌小鼠脑部的炎症,突触可塑性，GABA信号通路的传导的影响，以此来反映其对肠-肝-脑轴的影响，同时比较移植肝硬化患者粪便与无菌上清液前后对无菌小鼠大脑炎症的影响。研究证实了移植不同来源的菌群可以导致肝硬化相关脑部炎症的不同的响应，也是肝性脑病患者进行菌群移植后得到改善的部分原因所在，该发现为今后进行相关疾病的临床实践提供了重要参考。
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