科研 | New Phytologist：单细胞代谢组学研究生物碱细胞间定位的复杂性
编译：夕夕，编辑：十九、江舜尧。
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长春花是一种药用植物，因可以产生生物活性化合物长春花碱和长春新碱而闻名。这类化合物被归类为萜类吲哚生物碱类（TIAs）。尽管长春花的叶子是这类抗肿瘤药物的主要来源，但目前关于TIAs的前体是怎么在植物中合成大量TIAs的过程还不是十分清楚。本篇文章，使用Imaging MS和single-cell MS方法首次揭示了长春花叶片中细胞特异性的TIAs定位和积累。代谢研究揭示了大部分TIAs前体在表皮细胞中的定位，而大部分TIAs定位于异细胞。此外，研究者发现随着叶片的扩展，长春新碱的积累也在乳状细胞中增长。这些结果表明了植物代谢中细胞定位的复杂性。
论文ID
原名：The complexity of intercellular localisation of alkaloids revealed by single-cell metabolomics
译名：单细胞代谢组学揭示了生物碱细胞间定位的复杂性
期刊：New Phytologist
IF: 7.299
发表时间：2019年
通讯作者：Tsutomu Masujima
通讯作者单位：定量生物学中心(QBiC)，日本大阪（Quantitative Biology Centre)
实验设计
结果
长春花叶片中有不同的细胞类型：LPLC，IPAP，LEC，PTPC，STPC，PTIC，STIC，LLC。纤维观察叶片横切面可以看到异细胞似乎以无定型状态存在于薄壁组织中，维管束附近存在乳状细胞。通过紫外线照射可以将异细胞和乳状细胞与薄壁细胞区分开来。在叶原基中观察到乳状细胞的荧光，异细胞和乳状细胞的形态发生均始于叶原基，随着叶片扩展，异细胞和乳状细胞的数量也随之增加（图1）。
图1 长春花叶片异细胞和乳状细胞的定位
2. 叶片横截面的Imaging MS分析
目前，已有使用20μm空间分辨率的质谱成像探究长春花中TIAs的定位的研究。然而，由于叶片细胞的直径是10μm，当使用20μm的空间分辨率进行研究时，只能大致鉴定叶片组织中的一些组分定位，很难鉴定叶片组织中特定细胞类型的TIAs的定位（图2a）。尽管很难使用20μm的空间分辨率鉴定特定类型的生物碱，但是本研究使用了10μm的空间分辨率，提高了叶片组织中的TIAs定位的准确性。通过与20μm空间分辨率所得数据进行比较，本次研究精确的检测到了各种TIA化合物（图2b）。
通过本次研究，研究者检测到落干酸（m/z 415.1001）定位于维管束和表皮细胞中。尽管以前的研究表明大部分TIAs在表皮细胞中合成，但是本次质谱成像表明大量的TIAs最终积累于异细胞和乳状细胞中。
有研究表明长春碱主要定位于蜡层。由于以有研究证实了熊果酸存在于蜡层，所以作者使用熊果酸作为阳性对照，观察到熊果酸定位在蜡层。接着，研究发现长春碱不仅存在于蜡层也存在于异细胞和乳状细胞中。
图2 叶片组织的Imaging MS
3. 叶片组织的Single-cell MS分析
为了获得定量数据和TIAs的MS/MS数据用以证实Imaging MS的结果，研究者采用single-cell MS方法对韧皮部相关的薄壁细胞进行分析。本研究中，研究者在缓冲液中加入标液以校正单细胞质谱。
研究者使用single-cell MS和LC-MS数据分析长春花的TIAs（表1）。异细胞和乳状细胞结果表明TIA的主峰包括长春花碱和长春新碱。MS/MS检测到所有细胞类型中均有长春花碱的特异性片段峰。
表1 single-cell MS结果
4. PCA分析
PCA分析结果表明，异细胞和乳状细胞有很多相似特征，尤其是很多生物碱峰，m/z 349.15,m/z 427.22和m/z 457.23均定位于异细胞和乳状细胞。异胡豆苷的质荷比为m/z 531.23，这类化合物也定位于表皮细胞。PCA分析结果也表明，异胡豆苷高度定位于表皮细胞。
使用LC-MS方法分析长春花叶片的代谢情况。检测到了马钱子苷、文多灵和异胡豆苷等化合物的单峰。结合LC-MS结果，研究人员可以推断长春花叶片组织的每个细胞类型都有单一的分子类型。大部分TIAs都积累在异细胞和乳状细胞中，而异胡豆苷则积累在表皮细胞中（图3）。
图3 长春花碱叶片组织的single-cell MS半定量分析结果
6. 叶原基和叶组织间入职细胞的半定量比较
利用single-cell MS数据，作者计算了每种细胞中生物碱的含量（半定量）。尽管这种做法有一定的限制，但还是可以看出，不同组织中期代谢物的分布是不同的（图3）。为了鉴定第一片叶子中文多灵生物合成途径的中间产物，我们使用single-cell MS方法测量了乳状细胞中的内容物，研究人员怀疑文多灵积累在叶原基中。实际上，尽管检测到在叶片组织的乳状细胞中积累了大量的文多灵，但是通过代谢组的数据发现叶片的乳状细胞中积累了较少的文多灵。
代谢组数据分析揭示了文多灵积累具有组织特异性。T16H2是文多灵生物合成途径中的中间产物。由于T16H2可能协调文多灵和去甲氧文多灵分化途径有关。作者对T16H2进行了VIGS分析，以确定T16H2基因表达是否调节了文多灵和去甲氧文多灵在叶片扩展中的积累差异。VIGS分析表明，沉默T16H2会导致去甲氧文多灵随着叶片组织的扩展而积累（图四）。与对照组相比，沉默T16H2会导致去甲氧文多灵在叶片组织扩展中的积累增加14倍而文多灵的含量下降了2.3倍。
图 4 长春花碱叶片组织文多灵生物合成
结论
本研究中，作者使用了代谢组分析，Imaging MS和single-cell MS方法检测叶片组织中异细胞和乳状细胞中定位的TIAs。分析发现，异细胞和乳状细胞中含有大量的生物碱，例如异胡豆苷和文多灵等。其中，异胡豆苷是TIAs的前体，这些数据都表明TIAs的生物合成过程中异细胞和乳状细胞扮演着重要的作用。研究发现，在长春花茎和叶的乳状细胞中TIAs的组成成分有所不同。
总的来说，本研究强调了特定代谢通路的复杂性，并指出同一个生物合成途径中的中间产物可能定位于两个位置。毋庸置疑的，这种复杂性为这些复杂化合物的生物合成增加了一层控制。本研究表明，在构建代谢通路模型是应考虑所有分子的定位。
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