编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
肠道适应性免疫细胞是肠道组织稳态的关键因素，而且B细胞衍生的免疫球蛋白A（IgA）在肠道功能的建立中起到关键作用，T细胞非依赖性（TI）IgA识别大部分肠道微生物，T细胞依赖性（TD）IgA的诱导物种只有少数能被鉴定。为了研究一种与宿主代谢和PD-1检查点免疫疗法的全身影响相关的肠道细菌阿克曼氏粘蛋白降解菌(Akkermansia muciniphila)在诱导小鼠肠道细胞产生免疫球蛋白G1（IgG1）抗体和抗原特异性T细胞应答中的作用，科研人员构建了两种小鼠模型以模拟不同的肠道环境，通过对CD4和T细胞进行示踪标记以测定T细胞的功能，并用产生的I-Ab四聚体检测了所有肠相关的淋巴组织，对比于无病原体的小鼠，阿克曼粘蛋白降解菌小鼠引起更大的IgG1应答变异性，并且表征了常规条件下阿克曼粘蛋白降解菌的T细胞应答。研究结果显示阿克曼氏粘蛋白降解菌可以引起强烈的T细胞免疫应答，而且本研究结果确定了一个具有临床意义的重要目的，即共生体特异性T细胞应答可能偏向不同方向的机制。
原名：Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis
译名：Akkermansia muciniphila粘蛋白降解菌在体内稳态下引发的肠道适应性免疫反应
期刊：Science
IF：41.037
发表时间：2019.5
通讯作者：Gregory M. Barton
通讯作者单位：美国华盛顿西雅图癌症研究中心基础医学部
本文首先参照先前的研究方法利用小鼠血清和粪便二抗染色样品来见检查粪便中共生细菌与血清抗体的结合情况。从染色的粪便样品中分选出了IgG1结合和未结合的抗体以鉴定体液应答靶向的共生生物，并进行了16srDNA的测序分析，将结果IgG1阳性的粪便进行培养以分离出阿克曼氏粘蛋白降解菌进行后续的实验，并参照先前对依赖性免疫IgG1应答的能力和其对宿主生理学作用的报道，初步表征该种细菌引起的免疫应答。首先，使用流式细胞术分析了稳态下小鼠阿克曼氏粘蛋白降解菌阳性细胞中存在的该菌特异性IgG1抗体，并且比较了阿克曼氏粘蛋白降解菌阳性和阴性小鼠之间的IgG1抗体的应答差异。基于先前对阿克曼氏粘蛋白降解菌血清IgG1应答滴度在阿克曼氏粘蛋白降解菌重视可变的这一认知，但少数小鼠缺乏特异性抗体IgG1。后续研究人员为了确定黏膜免疫系统是否由阿克曼氏粘蛋白降解菌直接参与TD（T细胞依赖性）IgG1反应的基础，建立了一个确定的生殖系统，并且进一步探索了T细胞对阿克曼氏粘蛋白降解菌的反应，扩增了定殖阿克曼氏粘蛋白降解菌小鼠的肠细胞的T细胞系，利用杂交瘤细胞构建了转基因小鼠的模型。用先天性标记的CD4和T细胞以追踪T细胞对阿克曼氏粘蛋白降解菌的响应。内源性的阿克曼是粘蛋白降解菌特异性T细胞的追踪从外膜蛋白开始，产生了I-Ab四聚体，最后用四聚体探测了所有肠相关的淋巴组织，对比无病原体的小鼠，阿克曼粘蛋白降解菌小鼠引起更大的IgG1应答变异性，并且表征了常规条件下阿克曼粘蛋白降解菌的T细胞应答。
通过用配对小鼠血清和同种型特异性二抗染色粪便样品来检查血清抗体与完整共生细菌的结合。令人惊讶的是，比较野生型（WT）和T细胞缺陷（Tcrb- /-）小鼠显示小鼠产生微生物群反应性IgG1抗体完全依赖于αβ T细胞（图1，A和B，图S1，A至C），如先前报道的那样（图S1A），以TI的方式诱导抗血清IgG2b，IgG3和IgA。由TD IgG1结合的共生组分为~10％（图1B），远小于IgA，IgG2b和IgG3识别的百分比（图S1A）。因此，与结合多种细菌的多反应性TI抗体相比，小鼠产生的IgG1似乎仅识别肠中的一部分微生物。将足够的T细胞（Tcrb+/-）和Tcrb-/-携带的同窝仔畜与微生物群的组成对照进行比较，并且仅在Tcrb +/-小鼠中发现抗血清IgG1应答（图S1B）。此外，对来自多个供应商和不同遗传背景的小鼠的分析表明，该IgG1应答是健康小鼠的一般特征（图1C）。
图1 小鼠在体内平衡期间产生抗血清IgG1抗体。
为了鉴定这种体液应答靶向的共生物种，从相应小鼠血清染色的粪便样品中分选IgG1结合和未结合群体（图S2，A和B），并对结果部分进行16SrDNA测序。与IgG1阴性组分相比，在IgG1阳性级分中显着富集的OTU的分析揭示了两个主要的IgG1靶标（图1D和图S2，C和D）。这些OTU对应于阿克曼西亚属（OTU2）和拟杆菌属S24-7家族（OTU63）。阿克曼西亚是疣微菌门的共生属，它只包含一个成员阿克曼氏粘蛋白降解菌。阿克曼氏粘蛋白降解菌可以降解粘蛋白，并且是人类肠道微生物群的丰富成员。据报道，用阿克曼氏粘蛋白降解菌定殖对饮食诱导的肥胖具有保护作用，促进粘膜伤口愈合，并在抗PDD-1免疫治疗期间增加抗肿瘤反应。阿克曼氏粘蛋白降解菌介导这些不同作用的机制仍然知之甚少，因为对这种细菌的宿主感知知之甚少。因此，基于阿克曼氏粘蛋白降解菌诱导TD IgG1应答的能力及其对宿主生理学的报道的影响，本文试图表征对该细菌的免疫应答。通过在选择性培养基上铺板粪便从菌落中的分离出小鼠的阿克曼氏粘蛋白降解菌。然后使用细菌流式细胞术分析来确认在稳态下携带阿克曼氏粘蛋白降解菌的小鼠血清中存在的阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性IgG1抗体（图2A）。这些针对阿克曼氏粘蛋白降解菌的IgG1抗体应答可以由预先存在的天然多反应性特异性组成，或者可以是抗原特异性的。为了区分这些可能性，我们在其微生物群中鉴定了缺乏阿克曼氏粘蛋白降解菌的C57BL/6小鼠（图2B）。比较阿克曼氏粘蛋白降解菌阴性和阳性小鼠之间的IgG1抗体应答证实，阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性血清IgG1应答的诱导需要用阿克曼氏粘蛋白降解菌以及T细胞定植（图2，A至C，和图S3A）。阿克曼氏粘蛋白降解菌阳性小鼠也含有血清阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性TD IgA应答（图S3B）。此外，通过口服强饲法从头定殖阿克曼氏粘蛋白降解菌阴性小鼠足以诱导阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性IgG1抗体（图2，D至F和图S3C）。因此，对阿克曼氏粘蛋白降解菌的IgG1应答不是来自先前存在的交叉反应特异性。相反，小鼠在阿克曼氏粘蛋白降解菌定植时产生抗原特异性TD IgG1抗体应答。
图2 阿克曼氏粘蛋白降解菌对于诱导同源阿克曼是粘蛋白降解菌特异性IgG1抗体应答是必要且足够的
针对阿克曼氏粘蛋白降解菌的血清IgG1的应答在阿克曼氏粘蛋白降解菌阳性小鼠中是可变的。尽管有相似的定植，但少数小鼠完全缺乏阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性IgG1（图2，B和C，以及图S3A）。对这种可变性的一种解释是肠道微生物群落内的变异可能改变对阿克曼氏粘蛋白降解菌的反应。事实上，先前的研究表明肠道感染或炎症可导致旁观者对共生微生物的反应改变。为了克服这些困难，本文建立了一个确定的生殖系统，以确定粘液免疫系统是否由阿克曼氏粘蛋白降解菌直接参与TD IgG1反应的基础。为此，我们将阿克曼氏粘蛋白降解菌引入了用植物琼脂（ASF）改变定殖的无菌 C57BL / 6小鼠（24,25），除了ASF + Akk菌落中存在阿克曼氏粘蛋白降解菌，以产生具有相同微生物群的两个小鼠群体。阿克曼氏粘蛋白降解菌将ASF + Akk小鼠定植至高水平并垂直传播（图2G和图S3D）。将所有分析限制在通过垂直传播获得阿克曼氏粘蛋白降解菌的ASF + Akk小鼠的后代（或后代的后代）。用ASF + Akk菌群定殖的小鼠，但不是单独的ASF菌群，对阿克曼氏粘蛋白降解菌具有特异性的IgG1和IgA抗体应答，在小鼠之间非常一致（图2，H和I）。阿克曼氏粘蛋白降解菌直接参与免疫系统以诱导TD IgG1和IgA。为了探索T细胞对阿克曼氏粘蛋白降解菌的反应，本文从阿克曼氏粘蛋白降解菌定殖小鼠的肠组织中扩增阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞系，并通过与BWZ.36细胞融合产生T细胞杂交瘤（图S4， A和B）。通过筛选阿克曼氏粘蛋白降解菌基因组表达文库来鉴定刺激每种T细胞杂交瘤的克隆（图S4，C至E），鉴定了这些杂交瘤中的两种（124-2和168-H10）识别的抗原。124-2杂交瘤识别衍生自Amuc_RS03735的肽，Amuc_RS03735是含有外膜的自转运蛋白结构域的蛋白质。接下来，我们使用来自124-2T细胞杂交瘤的TCRa和TCRb链产生了阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞受体（TCR）-转基因小鼠（Amuc124）（图S4A和S5，A和B）。重要的是，后续将不含阿克曼氏粘蛋白降解菌定植的Amuc124小鼠用于所有后续实验。通过将幼年的、先天性标记的（Thy1.1）Amuc124 CD4+T细胞低频转移到ASF和ASF + Akk小鼠中来追踪T细胞对阿克曼粘蛋白降解菌的反应（图S6A）。阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞在ASF + Akk小鼠中扩增，但在ASF小鼠中检测不到，表明阿克曼氏粘蛋白降解菌抗原在稳态条件下呈现（图3，A和B;图S6，A和B;和图.S3A）。Amuc124 T细胞定位于Peyer's淋巴结（PPs）和肠系膜淋巴结（mLNs），但在大肠或小肠固有层（分别为LILP或SILP）中发现极少数细胞（图3，A和B，以及图S6B）。大多数转移的T细胞表达T滤泡辅助细胞（TFH）细胞标志物PD-1，Bcl6和CXCR5（图3C至E，以及图S6，C和D），其中一小部分采用调节性T细胞（Treg）标记FOXP3。在LP中可检测的少量T细胞也倾向于TFH细胞表型，最可能表明二级或三级淋巴组织未完全排除在这些制剂之外（图3F）。转移Rag1+/+或Rag1-/-的Amuc124 T细胞产生类似的结果（图S7，A至D）。令人惊讶的是，转移的T细胞表达T辅助细胞1（TH1），TH2或TH17细胞（分别为T-bet，GATA3或RORgt）的标记物未被检测到可观的数量（图S6D）。
图3 阿克曼氏粘蛋白降解菌在体内平衡期间诱导抗原特异性TFH细胞应答
为了追踪内源性阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞，我们从外膜蛋白Amuc_RS03735产生了载有肽TLYIGSGAILS（Thr-Leu-Tyr-Ile-GlySer-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser）的I-Ab四聚体（Am3735-1）（图S4，C至F）。在ASF + Akk的PPs中鉴定出内源性，四聚体阳性的阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞，而不是ASF小鼠（图3，G和H），与过继转移后用Amuc124 T细胞获得的结果一致。此外，通过四聚体染色鉴定的内源性阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞也表达TFH细胞标记物（图3，I和J）。具有来自Amuc_RS03740（Am3740-1）的不同阿克曼氏粘蛋白降解菌表位的独立四聚体产生非常相似的结果（图3，H至J）。最后，用四聚体探测了所有肠相关淋巴组织（LILP，PPs和SILP）和mLNs。在PP中检测到阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞，但在LP中没有检测到（图3K），这证实了用Amuc124T细胞转移获得的结果。因此，阿克曼氏粘蛋白降解菌在肠中诱导抗原特异性T细胞应答，其主要表现为PP中的TFH细胞。最后，文章回到特定的无病原体（SPF）小鼠，其中阿克曼氏粘蛋白降解菌 IgG1应答的更大变异性，并且在常规微生物群的背景下表征了对阿克曼氏粘蛋白降解菌的T细胞应答。与我们对ASF系统的研究结果相似，转移的Amuc124 T细胞扩增并定位于阿克曼氏粘蛋白降解菌阳性小鼠的PPs，但在阿克曼氏粘蛋白降解菌阴性小鼠中检测不到（图4，A和B，以及图S8A）。PP中的大多数转移的T细胞也采用TFH细胞标记物（图4C和图S8B）。因此，阿克曼氏粘蛋白降解菌还在复杂的微生物群的背景下诱导TFH细胞应答。然而，与ASF + Akk系统不同，在阿克曼氏粘蛋白降解菌阳性小鼠的肠道LP中检测到更多数量的转移T细胞（图4B），其中一些采用与促炎性T细胞命运一致的标记物（图4，D和E，以及图S8，C到E）。尽管存在阿克曼氏粘蛋白降解菌，一些SPF Akk +小鼠组在转移后检测不到T细胞活化和增殖。因此，对阿克曼氏粘蛋白降解菌的T细胞应答似乎是背景依赖性的，导致在某些条件下除TFH细胞外还诱导其他CD4T效应。有趣的是，与已经描述的分段丝状细菌（SFB）和幽门螺杆菌相比，SPF小鼠中对阿克曼氏粘蛋白降解菌的T细胞应答在不同的CD4 T细胞之间混合（图S8E）。
图4 阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞在复杂微生物群的背景下也采用其他生存方式
先前认为共生特异性TD抗体仅限于对一小部分共生物种特异的IgA反应。本文工作表明，这种TD抗体还包括IgG1，它识别一小部分共生体，包括阿克曼氏粘蛋白降解菌。这些细菌可能具有某些特征，例如接近肠上皮，这可能增加它们在屏障破坏期间引起疾病的可能性。事实上，据报道，对共生细菌具有特异性的系统性抗体可以预防肠道来源的败血症，并且阿克曼氏粘蛋白降解菌可以在某些免疫缺陷环境中促进疾病的发生。
迄今为止，已经鉴定出很少的共生抗原，其在体内平衡期间导致肠中的抗原特异性T细胞应答。SFB和幽门螺杆菌属两者都引起非常明显的反应。SFB在常规和单核化小鼠中均诱导RORgt + TH17细胞，而螺杆菌属在LILP中诱导RORgt +FOXP3 + iTreg细胞。TFH细胞构成SFB-和幽门螺杆菌特异性T细胞的一小部分，但这些细胞分别处于TH17细胞或Treg主导的反应中。已经提出肠中的TFH细胞与TH17细胞或Tregs分化。相比之下，ASF + Akk系统产生共感特异性T细胞应答，其主要是TFH细胞的诱导，具有非常少的Treg，TH1，TH2或TH17细胞。因此，共生体特异性TFH反应可以发生在没有不同的原发性CD4 T细胞反应的情况下，并可能与肠系膜淋巴结或PPs中未分化的共生体特异性T细胞区分开来。因此，阿克曼氏粘蛋白降解菌似乎以不同于先前描述的T细胞活化共生细菌的方式参与粘膜免疫系统。这种共生特异性TFH反应与强大的抗血清TD IgG1和IgA一起出现。
令人惊讶的是，在常规微生物群的背景下，除了诱导TFH细胞外，阿克曼氏粘蛋白降解菌还可以诱导LP所在的其他的CD4 T细胞。总之，这些结果支持这样的假设：T细胞对共生体的反应可能是背景依赖性的，不仅在急性胃肠道感染或炎症的情况下，而且存在于体内平衡期间。与某些微生物的相互作用可能改变阿克曼氏粘蛋白降解菌的定位或功能，或者由其他微生物提供的信号可能形成针对该共生细菌的免疫应答。
先前的工作已经确定阿克曼氏粘蛋白降解菌介导对宿主代谢的影响，并且可以影响基于抗PD-1的免疫疗法对抗癌症的功效。这些作用的机制仍然知之甚少，但两者似乎都是免疫介导的并且与1型免疫相关。特别是，人体对抗PD-1的免疫治疗的反应与体外与阿克曼氏粘蛋白降解菌抗原孵育的外周T细胞的干扰素γ产生相关。有趣的是，并非所有患者都产生针对阿克曼氏粘蛋白降解菌的1型反应。文章结果为这种不同的反应提供了可能的解释，并表明由于微生物群组成或其他环境信号的差异，个体中阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性T细胞反应的差异偏斜可能具有深远的系统效应。确定这些共生特异性T细胞应答可能偏向不同的机制是一个具有明确临床意义的重要目标。
肠适应性免疫反应影响宿主健康，但是已经鉴定出仅在体内稳态期间诱导同源适应性免疫应答的少数肠细菌物种。在这里，我们显示阿克曼氏粘蛋白降解菌，一种与宿主代谢和PD-1检查点免疫疗法的全身影响相关的肠道细菌，在小鼠中诱导免疫球蛋白G1（IgG1）抗体和抗原特异性T细胞应答。与先前表征的粘膜反应不同，T细胞对阿克曼氏粘蛋白降解菌的反应限于在生殖环境中的T滤泡辅助细胞，没有明显诱导其他T辅助命运或迁移到固有层。然而，阿克曼氏粘蛋白降解菌特异性反应是依赖于背景的并且在常规小鼠中采用其他命运。这些发现表明，在体内平衡期间，背景信号影响T细胞对微生物群的反应并调节宿主免疫功能。
肠道适应性免疫反应宿主的健康状况，而且适应性免疫细胞是肠道组织稳态的关键因素。因此，本文以阿克曼氏粘蛋白降解菌，这种存在于肠道的细菌为中心，展开了对该菌是否会引起肠道免疫球蛋白的应答的研究，结果发现在阿克曼氏粘蛋白降解菌存在的情况下会检测到肠道T细胞的免疫应答，而且发生在体内稳态期，研究结果明确了一个重要的临床针对应答偏向不用途径的共生特异性T细胞的机制，临床生具有重要意义。
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