科研 | SBB：在长期受氮沉降影响的南亚热带森林中氮添加降低土壤细菌丰富度，而磷添加改变物种群落组成(国人作品)
编译：丰巢智能柜，编辑：小菌菌、江舜尧。
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由于人类活动的影响，大量的化石燃料燃烧以及农牧业氮肥的广泛使用，全球大气氮沉降量明显增加，尤其是我国南方。我国南亚热带森林长期受氮沉降影响，土壤酸化严重，同时南方亚热带森林土壤高度风化，成土过程中，母质中大量P素通过淋溶和固定而不断减少，使得土壤中有效磷不断减少，因此P素是限制南方亚热带森林生物多样性的重要因素。但是长期的N沉降和P限制会对南亚热带森林土壤微生物多样性在分子水平上产生怎样的影响呢？这个问题仍有待探究。本研究选址于广东省肇庆市鼎湖山自然保护区，以该区域内的南亚热带森林为研究对象，进行为期6年的氮磷添加实验，从土壤理化性质、林下植被状况以及细菌群落组成等多角度来解析N、P添加对南亚热带森林土壤的影响，深入了解氮磷元素在塑造土壤细菌群落组成的不同作用。
论文ID
原名：Nitrogen addition reduces soil bacterial richness, while phosphorus addition alters community composition in an old-growth N-rich tropical forest in southern China
译名：在长期受氮沉降影响的南亚热带森林中氮添加降低土壤细菌丰富度，而磷添加改变物种群落组成
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.3
发表时间：2018.8
通讯作者：刘世荣&莫江明
作者单位：中国林业科学院森林生态与环境保护研究所&中科院华南植物园
实验设计
1 研究地点
该研究选址于广东省肇庆市鼎湖山自然保护区，该区域为季风气候，75%的降雨量主要集中于3-8月，研究人员在海拔300米的季风常绿阔叶林建立研究位点，该区域的森林代表该地区的气候顶级群落，受人为干扰较少，已经被保护超过400年，林地成土母岩为砂页岩，土壤由红壤构成。主要的林下植被种类包括锥栗、华润楠、木荷、黄果厚壳桂等，在实验开始前，对该实验区域做了样地调查，样地内的锥栗（Castonopsis chinensis）、华润楠（Machiluschinensis）、木荷（Schima superba）、厚壳桂（Cryptocaryachinensis）、红枝蒲桃（Syzygiumrehderianum）以及其他植物的茎秆密度分别为268，131，185，270，185和1587/公顷。
2 实验设计
该研究通过氮磷添加研究在氮沉降背景下，长期氮沉降对土壤微生物多样性的影响及相应的响应机制，实验设计为：4处理×5重复，具体为：N添加（150kg N ha-1 yr-1）、P添加（150kg Pha-1 yr-1）、NP（150kg N ha-1 yr-1 + 150kg P ha-1yr-1）互作以及对照组。在同一坡度上，建立20个5m×5m的小样方，不同的样方之间设置＞5m的缓冲带，以避免不同样方之间的相互干扰。分别选用NH4NO3和 NaH2PO4作为N肥和P肥，频率为每两个月1次。将NH4NO3和NaH2PO4溶解于5L的水中，使用背式喷雾器喷施，照组则喷施5L水即可，相当于1.2mm的年降雨量。
3 样品采集及测定
使用直径2.5cm的土钻在每个样方内随机取10cm深的土壤5钻，混合均匀后过2mm筛，去除植物残根和石块。测定土壤理化性质pH、SOC、TN、NH4-、NO3-、AP以及TP。
4 林下植被现状
林下植被的测定：将高度＜1.5m的维管植物定义为林下植物，在土壤取样的同时，在每个25m2的样方内随机选取一个1×1m的小样方进行林下植被监测，测定指标包括物种丰富度species richness（平均种类数/m2），个体多度（株/m2）以及覆盖度。
5 DNA提取和16S rDNA扩增测序
结果
1 N、P添加对土壤和植被的影响
N添加显著增加了有效N的含量，主要表现为NO3-形式（Fig.1a和b），降低了土壤pH（Fig.2a）。P添加显著增加了TP和AP的含量（Fig.1b和c），降低NO3-含量。NP互作的土壤NO3-含量显著低于N添加处理，与空白组相比，N添加以及NP互作下的NO3-含量无显著性差异（Fig.1a）。N、P添加对土壤有机碳无显著影响（P＞0.05）。NP互作下的土壤pH显著高于P添加，与空白组相比，N添加以及NP互作中的土壤pH无显著差异（Fig.2a）。N添加显著降低了林下植被的丰富度，覆盖度以及多度（Fig.2b-d）。同样，P添加显著降低了林下植被多度（Fig.2d）。对林下植被覆盖度而言，施氮使得林下植被的覆盖度显著低于空白组，而NP互作、P添加处理下的植被覆盖度与空白相比无显著差异（Fig.2c）。施加N、P以及NP互作下的林下植被丰富度、多度均显著低于空白对照组（Fig.2b ,d）。同时，研究人员还观测到N、P互作对林下植物个体多度的互作作用。但是，未观测到N、P添加对土壤pH、有效N、NO3-、TP以及林下植被丰富度以及覆盖度的交互作用。
图1 不同处理的土壤NO3-N、有效N、有效P、总P含量等方面的比较。土壤性质的两因素方差分析结果在子图中展出。土壤样品分析时间为2013年6月。图中的值为平均数±标准误（n = 5），不同的小写字母表示SNK检验的多重比较比较结果，显著性水平为α= 0.05
图2. 与对照相比，不同N、P处理对土壤pH、植物丰富度、林下植被覆盖度、以及林下植物个体多度的影响
2 N\P添加对土壤细菌α多样性的影响
这里，以Chao1指数作为度量细菌丰富度的指数，施N显著降低土壤细菌α多样性（Fig.3），而施P则对细菌丰富度无显著影响（Fig.3）。同时施加N、P时，土壤细菌多样性显著低于空白组，而细菌多样性在N处理和NP处理中并无显著性差异。在整个过程中，并未观测到NP互作对细菌丰富度显著影响（Fig.3）。Shannon-Wiener指数不受N添加以及P添加的影响（P＞0.05）。
图3. 不同处理间的土壤细菌丰富度指数Chao1的比较。两因素方差分析的结果间子图。图中的值为平均数±标准误（n = 5），不同的小写字母表示SNK检验的多重比较结果，显著性水平为0.05
植物丰富度、土壤细菌丰富度与氮、磷添加相关的调控路径模型得到了所有的统计检验的支持（ᵡ2=15.714，p = 0.265，CMIN/df = 1.209，GFI =0.815，CFI = 0.967，RMSEA ＜ 0.05）（Fig. 4）。结构方程模型分析分别占土壤pH、NO3-、AP、植物丰富度和土壤细菌α多样性变异的64%、44%、88%、66%以及20%（图4）。土壤pH的降低源于直接N添加和间接的NO3-增加。N添加造成土壤细菌丰富度的下降，更多可能是由于其对土壤pH的负面影响（Fig.4）。施加营养元素，使土壤NO3-以及AP浓度的升高，导致林下植被丰富度降低。然而，林下植物丰富度的变化并没有导致土壤细菌丰富的相应变化。
图4 结构方程模型分析描述植物丰富度和土壤细菌α多样性在施氮、施P、pH、NO3-以及有效P的调控下的路径。箭头线上的数字是标准化的直接路径系数，N、P之间的双箭头实线表明SEM中考虑了N、P互作效应，别的带箭头实线表明正向作用，虚线表示负向作用。
3 N\P添加对土壤细菌群落组成的影响
本研究选取的分类水平为纲水平，所有20个样本中土壤细菌群落以酸杆菌纲（Acidobacteria 31.1%）、放线菌纲（Actinobateria 14.0%）、α变形菌纲（Alphaproteobacteria 13.7%）、γ变形菌纲（Gammaproteobacteria9.0%）为优势菌，其他分类群的丰度都很低。P添加显著降低了α变形菌纲（p = 0.038）和嗜热油菌纲（Thermoleophilia）（p = 0.029），而N添加和NP互作对优势菌群无显著影响。
图5.不同处理下的样品土壤细菌群落组成结构，图中仅显示相对丰度大于1%的物种，而小于1%的物种归在“other”
研究者使用db-RDA（偏冗余分析）来评估所有样本土壤细菌群落组成的差异。两因素PERMANOVA分析结果表明P添加显著影响土壤细菌群落组成（p = 0.006），而氮添加以及氮磷互作对土壤细菌群落组成无显著影响。此外，从冗余分析的结果中可以看出细菌群落组成的变化（Fig.6）。AP含量和林下植物覆盖度是驱动土壤细菌群落结构变化的主要因素（Fig.6）。
图6.不同处理下的土壤细菌群落组成与环境因子之间的db-RDA分析，图中有效磷（AP）和林下植被覆盖度（Pcover）为与土壤细菌群落组成存在显著相关性的两个因素
讨论
1 氮素添加降低土壤真菌丰富度，而非P素添加
分子分析揭示了森林生态中营养元素添加对土壤细菌的影响。在本研究中，N素添加提高了土壤NO3-浓度，同时降低了土壤pH值（图1a和2a）。同时N添加降低土壤细菌群落的丰富度，表明连续6年的N添加主要减少了亚热带森林土壤细菌种类的数量。这些结果支持了我们的第一个假设，即N添加降低土壤细菌丰富度。在一些热带雨林、温带森林、草原以及北极苔原生态系统中的研究中，N添加同样导致土壤细菌多样性的降低。细菌对N沉降的响应极大地依赖于土壤营养元素的有效性和土壤酸化状况。我们所研究的森林土壤属于高度酸化，对酸敏感，土壤pH＜4，碱饱和度＜5%，同时交换性H+和Al3+是土壤交换性阳离子库的主要成分。土壤细菌群落多样性经常被报道与土壤pH有关，甚至在大尺度上，细菌生长的最适pH范围很狭窄，可能是导致细菌丰富度降低的主要原因。本研究中土壤pH值（平均值±标准差 3.65±0.11）低于巴拿马元素添加实验（pH = 4.47 – 5.36）。在巴拿马实验中，氮添加导致土壤pH比对照组低了0.8个单位，并且氮添加抑制了土壤原核生物的丰富度。本研究中，施氮引起的pH值下降了0.2个单位和土壤细菌丰富度的下降有关，表明在高度酸化的富N亚热带森林中，pH小幅度下降可能会对土壤细菌α多样性产生明显的影响。
此外，土壤酸化导致Ca、Mg离子的有效性发生变化，同时也会造成有毒矿物Al离子的移动，这些都可能间接影响土壤微生物群落结构。Al/Ca比的增加和碱饱和度的降低进一步表明，在目前的森林生态系统，氮素的输入加速了土壤酸化。土壤中的阳离子交换能力（CEC）对土壤细菌群落的变化有重要影响，因为土壤的阳离子交换能力影响土壤对酸化的敏感性以及对养分阳离子的截留能力。在本研究的样地开展的另一个营养元素添加试验中，6年的氮添加导致了盐基阳离子的消耗，这进一步降低了酸中和能力，增大土壤阳离子交换能力。而且，施氮后，土壤有机质质量和数量的的变化与土壤微生物特征和酶活性的变化有关。虽然本研究中土壤有机质含量在不同处理间无差异，但是7年的添加降低了可溶性C的淋溶，这可能增加了周围邻近土壤的C固存。
革兰氏阳性细菌拥有比革兰氏阴性细菌更薄的细胞壁，革兰氏阳性菌细胞壁中丰富的阴离子磷壁酸能与阳离子结合，起到阳离子稳态的作用；革兰氏阳性菌通常是寡养的K-策略者而革兰氏阴性菌是共营养的r-策略者。本研究中，N添加降低了革兰氏阴性菌的的丰度，可能导致在N素添加胁迫下土壤细菌丰富度降低。
施P对土壤α多样性无显著影响，表明随着磷有效性的提高，土壤细菌α多样性保持稳定。在本研究中，施磷能够增加AP、TP以及NO3-含量，但是对土壤pH无影响（Fig.1和2），因此，土壤细菌丰富度对磷添加无显著性影响可以解释为磷的输入并没有缓解过量氮素引起的土壤酸化。然而，以往的研究中，在南亚热带原始森林和次生林中，土壤真菌和细菌生物量随着磷添加而增大。土壤微生物对磷添加的响应可能因土壤碳的有效性的变化而变化，因为一些研究表明，当碳的有效性较高时，微生物生物量和活性更可能受到磷的限制。磷添加引起植物生长速率的增加和植物输入到土壤中的碳增加，可能提高土壤微生物活性。
2 磷添加改变土壤细菌群落组成
土壤细菌群落组成和土壤和植物特性以及植物-微生物相互作用有关。因此，我们预测在施加营养元素后土壤细菌群落组成发生变化。事实上，多元变量分析揭示了磷添加一起了土壤细菌群落β多样性的显著变化，磷的有效性和林下植物覆盖度和土壤细菌群落组成最相关。在db-RDA分析中，磷的有效性指向了磷添加和氮磷互作条件下主要土壤细菌群落（Fig.6）。在受氮沉降严重影响的南亚热带森林中，通过外源磷输入，提高土壤磷素的有效性，改善土壤养分平衡，有助于细菌群落组成的变化。施磷加速土壤中不稳定土壤碳的矿化，还可以满足土壤微生物对能量和养分的需求。嗜热菌属于放线菌门，放线菌和α变形菌属于共营养微生物群。因此，我们预计这些细菌会快速生长，然而，在本研究中，过量的磷添加降低了α变形菌和嗜热菌的丰度。这些结果表明，在含氮丰富的森林生态系统中，长期施磷后土壤细菌群落可能不会受到磷的限制。在以往的研究中，就真菌和细菌比而言，磷添加改变了南亚热带森林土壤微生物群落组成。本研究进一步发现，土壤细菌群落组成在OTU水平上随磷添加而发生变化，此外，这项研究还探究了土壤参数、林下植被参数以及土壤细菌群落组成之间的潜在互作关系。
结论
在本研究中，我们观测到长期处于的富氮南亚热带森林，由于长期的氮、磷添加引起土壤细菌分子多样性变化。氮的添加量对土壤细菌丰富度有负面影响，可能是由于氮输入引起的土壤持续酸化。氮磷互作缓解了土壤NO3-和pH对单独施加氮的响应，由于南亚热带森林长期处于富氮状态，磷的输入不能缓解过量氮沉降所引起的土壤细菌丰富度下降，此外，磷添加改变了土壤细菌群落组成。施磷提高了磷的有效性，氮输入降低了林下植被覆盖度，这些促进了土壤细菌β多样性的变化。这些结果表明，6年的施氮和施磷对该生态系统的土壤微生物多样性和群落组成有不同的影响。
评论
该研究通过氮、磷添加实验来探讨在大气氮沉降以及磷素匮乏的背景下，施加营养元素对地上及地下生物多样性的影响以及相应的响应机制。研究发现，氮输入直接导致土壤pH的降低，间接引起NO3-含量的增加，N的输入引起土壤细菌丰富度下降，可能是通过pH的影响，磷的输入改变了细菌群落组成，虽然文中给出了一定的解释，具体的优势细菌如何应对氮磷添加，以及会对其他微生物以及植物的影响如何，仍有待进一步探索。
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