科研 | 中科院昆动所SBB：水稻超高产的土壤微生物机制
编译：A国民少女，编辑：小菌菌、江舜尧。
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提高稻米单产潜力对全球粮食安全至关重要。中国的桃园市以超高水稻产量的特殊生态基地而闻名世界。已经确定了影响这种现象的气候因素，但是促进超高产量的潜在分子过程和环境机制仍然是个谜。这项研究提供了关于水稻四个关键生长阶段从土壤微生物群落结构到宏基因组功能的因素的详细结果，以及氮富集实验和水稻根转录组分析的结果，以确定潜在的影响超高产量的土壤生物因子。我们的结果表明，桃园具有比常规站点更多的细菌分类单元，更少的真菌分类单元以及在微生物分类单元之间的10倍更强的连接以及营养传递功能的比例更高。值得注意的是，我们的宏基因组分析表明，桃园包含更多的具有氮代谢功能的类群，以及参与硝化过程的基因（例如，羟胺氧化还原酶和一氧化氮双加氧酶）含量更高，从而促进了铵（NH4 +）有效转化为硝酸盐（NO3-），并刺激稻根中硝酸盐转运蛋白的高表达，从而导致超高产量。研究结果揭示了促进桃源超高水稻产量的非气象机制，从而增强了对超高产量作物中潜在的土壤微生物机制的认识。
论文ID
原名：Soil microbial mechanisms promoting ultrahigh rice yield
译名：水稻超高产的土壤微生物机制
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2020.1
通讯作者：王文
作者单位：中国科学院昆明动物研究所
实验设计
本研究是在桃园（100.25E，26.86N）进行的，这是一个记录世界水稻产量最高的著名地点，而中国云南省景洪（ 100.79 E，22.00 N），一个典型的水稻种植区，它被用作对照点（补充图S1）。桃园和景洪的年平均气温分别为20.6°C和20.2°C，年平均降水量分别为629.7 mm和1,450 mm。我们建立了15个平方米的地块的3个副本，并在整个生长期进行了仔细的表型分析。为了避免产量下降，控制了水，杂草，昆虫和疾病。 2014年，在分蘖（S1），抽穗（S2），孕穗期（S3）和籽粒灌浆（S4）阶段，从土壤层的前20cm随机获得了9个土壤和根样品，并分别进行组合使用内径为5cm的无菌土壤去核剂重复样地，在四个阶段为两个位置总共生成24个土壤样品和24个根样品。每个土壤7个样本分为两个子样本。将一个子样品放入50mL无菌离心管中，用液氮冷冻，并在提取DNA之前保存在-80°C下，将另一个土壤子样品转移至实验室，在空气干燥后分析其理化性质。土壤的理化特性包括土壤pH，土壤有机碳（SOC），总氮（TN），NH4+和NO3-氮和总磷（TP）。从根部收集的微生物被定义为内球微生物。
使用E.Z.N.A.从0.5g土壤或根样品中提取基因组DNA。我们使用引物515F/ 806R和ITS1扩增了细菌的16S rRNA基因的V3-V4区。在Illumina HiSeq 2500（250 bp配对末端测序）平台（Illumina Int）上对纯化的扩增子进行测序。OTU使用UPARSE（7.1版）以97％的同一性截止值聚类，并使用UCHIME算法识别并去除了嵌合序列。
使用用于Illumina的NEBNext®Ultra™DNA库制备试剂盒生成测序库，并将索引代码添加到其相应的样品中。计算和统计分析R软件（版本3.5）用于所有统计分析。使用“ Shannon”方法从功能多样性中计算出α多样性测量值。网络中的节点表示OTU（或KO基因），而边缘表示节点之间的显着相关性（正或负）。此外，根据以前的工作计算出节点和边的数量，平均路径长度，网络直径，累积度分布，聚类系数和模块化，并使用交互式平台Gephi可视化网络。
结果
1 桃园市土壤微生物组群落结构特征
桃园的平均细菌群落香农指数（10.64±0.065）高于景洪（10.4±0.035）（ANOVA，p <0.01），特别是在分蘖期（S1）和抽穗期（S2）期间（图1A）。然而，桃园的真菌群落香农多样性（5.08±0.318）低于景洪（6.17±0.222）（ANOVA，p <0.05），在生育后期处于最低的多样性，与景洪的趋势相反（图1A）。桃园比景洪有更多的16S操作分类单位（OTU）（2,406个唯一的OTU），但ITS的OTU比景洪要少（图1B）。桃园的细菌群落结构与景洪的细菌群落结构显着不同（图1C），桃园和景洪的25个门和32个属的丰度显着不同（FDR调整后的p值<0.05）（补充图S3A， D）。桃源和景洪中最丰富的类群是菌群细菌（从33.34％到37.13％），放线菌（17.23％到27.46％）和绿弯曲菌（8.5％至6.8％）（图1D），但不同的只有绿弯曲菌在两个站点之间有明显差异（补充图S3A，D）。桃园主要真菌Ascomycota的数量随着生长期的增加而大量增加，而Basidiomycota则随着生长期的增加而减少，而景洪则呈现相反的趋势（图1D）。。
图1 两个地点的土壤微生物组群落结构。（A）水稻四个生育阶段桃园和江南的香农指数（16S）和真菌（ITS）的箱线图。方框上方的字母表示两个站点之间的阶段之间存在显着差异（p <0.05，n =3）。（B）桃园和景洪的16S及其ITS OTU的维恩图。（C）根据未加权和加权UniFrac距离，基于每个位置的细菌和真菌群落组成的前两个主要成分的PCoA图。（D）在所有处理中，细菌（上组）和真菌（下组）在菌门水平的主要分类组的相对丰度。
2 桃园市土壤微生物组群落功能特征
为了检测超高产土壤中的微生物群落功能特征，使用KEGG数据库对土壤宏基因组读数进行注释（图2，补充表S6），并鉴定了5,386个基因。桃园和景洪之间基于基因注释的微生物群落功能显着不同（图2A）。相对于景洪，桃园地区共有1898个KEGG Orthology（KO）基因（占所有KO基因的35.4％）被显着上调，而464个KO基因（占所有KO基因的8.6％）被显着下调（图2B）。明显不同的基因聚集在KEGG途径3级，并属于不同的功能组（图2C）。桃源区的肽酶（PD），膜和细胞内结构（MIS）和转运蛋白（TraP）三个功能基团的丰度分别比景洪的分别高12.5、28和5.9倍。有趣的是，桃园样品中丰富的功能在不同的生长阶段之间没有差异（p> 0.05）（补充图S5）。此外，桃园地区的七个功能基团，即核糖体，原核生物中的碳固定途径，氧化磷酸化，柠檬酸盐循环（TCA循环），光合生物中的碳固定，C5分支的二元酸代谢和丙酸酯代谢显着降低。这些与能量代谢和碳水化合物代谢有关的功能是管家基因。
3 微生物群落中OTU之间和基因之间的强相互作用
为了可视化桃园中显着富集的功能特性与土壤微生物分类特性之间的关联，我们确定了所有样品的土壤富集功能特性的分类起源。确定了桃园和景洪之间显着不同的3级KEGG途径（补充图S6）。蛋白酶是这些功能的主要贡献者，但对桃园的贡献（分别为PD，MIS和TraP的归一化总相对贡献的50.9％，71.4％和63.7％）少于景洪样本（80.9％，79.4％，（81.8％），这表明桃园中的非蛋白细菌与景洪中的细菌具有相同的功能，可能在功能上是多余的（补充图S7和S8）。在桃园，观察到属于放线菌，芽孢杆菌和硝化螺旋菌类群的贡献增加（图S6）。 Thaumarchaeota是桃园特有的古细菌（补充图S2C），对PD，MIS和TraP的三个功能类别的贡献分别为0.24％，0.43％和0.95％。共现网络分析表明，桃园土壤群落中细菌和真菌之间的结节数和连通度（包括正相关和负相关）都比景洪高（图3A，B）。桃园的节点连通度更高：细菌和真菌的平均连通度分别为5.884和6.719，分别比景洪市高3.9和2.64倍（补充表S8）。对于细菌群落和真菌群落，桃园的网络直径也比景洪的网络直径大（补充表S8）。令人惊讶的是，桃园网络显示出KO基因之间有191个相关节点，而景洪市中的基因之间没有相关性（图3C）。
图3 两个地点的微生物群落中OTU与基因之间的关系。桃园和景洪市细菌群落（A），真菌群落（B）和功能基因（C）的网络共现分析。每个点代表细菌/真菌系统型（OTU聚集在97％）或KO。景洪市的基因之间没有相关性。因此，该位点的基因网络未在图中显示。连接表示统计上显着的（p <0.01）Spearman相关性，系数>0.6。每个节点的大小与连接数（即度数）成正比。每个节点都在门级进行标记。
4 微生物与水稻氮吸收对土壤氮循环的促进作用
我们的规范相关分析（CCA）结果表明，土壤理化性质和气象因素均会影响土壤微生物群落（图4A，B）。土壤特性与细菌和真菌群落的相关系数高于气象因子。桃园的土壤pH，TP和NO3-与细菌群落结构（分别为r2 = 0.93、0.76和0.82）和真菌群落结构（分别为r2 = 0.99、0.91和0.92）显着相关（图4A，4B）。在高度丰富的微生物菌群与pH，TP和NO3-之间也发现了显着的正相关（图4C）。我们的田间试验表明，桃园地区的水稻具有很高的氮（N）吸收和利用能力（图5A），并且水稻植株的转录组处于四个关键阶段（分蘖（S1），抽穗（S2），孕穗期（S3）和籽粒灌浆（S4））表明差异表达的基因在氮化合物的代谢过程中富集。一致地，基于根转录组，在S1时，桃园中所有硝酸盐转运蛋白基因的表达均比景洪高5.26倍（图5B），与水稻高产相关的转运蛋白在桃园和景洪水稻中表现出显着差异（图5B，5C）。在桃园土壤中观察到较高的土壤NO3-含量和较低的NH4 +含量。此外，桃园微生物组中的硝化途径基因（氨氧化酶（amo A / B / C），羟胺氧化还原酶（hao）和一氧化氮双加氧酶（结节，己糖单磷酸途径（hmp）酶））的丰度明显大于景洪微生物组（图6A，6B）。具有硝化功能（KO ID）的属的丰度示于图6B，6C中。例如，Nitrosomonas具有amo酶基因；Fibrisoma，Sporocytophaga和Starkeya具有hmp酶基因。 Frankia，Trichodesmium和Haliangium都有hao酶基因。
图4 环境因素与土壤微生物群落之间的关系。 CCA结果的排序图用于根据扩增子测序数据探索细菌（A）和真菌（B）的微生物群落，土壤特性和气象因子之间的关系。箭头表示长度，解释变量和响应变量之间的夹角反映了它们的相关性。SOC表示土壤有机碳，TN表示总氮，TP表示总磷，NO3-硝酸盐氮，NH4+铵盐，MMT到月平均温度，MP到月平均降水，MRH到平均相对湿度，MTD到平均温差。表S5中显示了每个因子的r2和p值。（C）显示了基于Spearman相关系数的环境因素与微生物群显着改变之间的相关性。颜色代表Spearman相关系数的值；红色表示正相关，蓝色表示负相关。聚类方法是使用R中的“ pheatmap”包对行和列进行“完整”处理的算法。*方框中的值表示p<0.05时具有显着相关性。
图5 在两个位置上水稻的氮同化。（A）不同氮肥处理方式下桃园和景洪的水稻产量。 *表示在相同氮含量下，桃源的产量显着高于景洪的产量（p <0.05，n =4）；大写字母表示桃园（Duncan）测试的结果；小写字母表示景洪市的此类结果。（B）在S1和S3期间，每个位置的水稻根系中的铵转运蛋白（AMT）和NRT的每百万个外显子的每千碱基外显子总片段数（FPKM）。（C）在S1和S3阶段，与高水稻产量相关的特定转运蛋白的倍数变化。
图6 土壤微生物氮循环。（A）基于Kuypers等人的综述，描述了土壤中微生物氮化合物的转化途径。实线代表能够鉴定我们的元基因组数据中的基因的途径。虚线代表文献中报道的途径，但在我们的数据集中未找到相关基因。（B）桃园和景洪四个生育阶段的土壤氮循环基因相对丰度。（C）氮循环中或文献中报道为潜在具有硝化功能的基因的微生物属相对丰度。使用基因家族R中的“比例”功能对数据进行标准化。
结论
本研究结果表明，桃园的氮素吸收和根系硝酸盐转运蛋白的表达能力明显高于景洪。此外，土壤微生物群落结构和功能的研究结果表明，桃园比景洪具有更多的细菌类群和较少的真菌类群。桃园养分转运基因的比例显著丰富，而微生物类群之间的联系程度更高，可以促进土壤养分转运。值得注意的是，我们的宏基因组分析表明，桃园有更多的类群（如Thaumarchaeota和Nitrospira）具有氮代谢功能，并且硝化过程中涉及的基因丰度更高（如hao和hmp），从而促进了NH4+向NO3-转化的有效性。并可能导致水稻根系中硝酸盐转运蛋白的高表达。这些与土壤微生物组有关的因素对水稻转录组的影响揭示了促进超高产量的非气象机制。我们的研究结果增强了土壤微生物组对农作物生长的影响的知识，并可能通过协调有益的土壤微生物群落来提高水稻的产量。
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