科研 | ISME：硝化螺菌群的功能多样性主导着污水处理厂生物反应器微生物群落
编译：国民少女，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
废水中含有大量的铵，铵的存在可能会导致水体富营养化、耗氧量增加、也会威胁到水生动物的健康。而硝化作用（通过亚硝酸盐将铵氧化为硝酸盐）是市政废水处理厂除铵的重要过程。目前有些研究人员发现了消化螺菌属在完全氨氧化方面发挥的作用，该类群菌的发现彻底改变了传统硝化作用的认知，其在生物地球化学氮循环中可能具有很重要的作用，并也为硝化作用的研究提供了新思路。
为了研究其在污水处理过程中所发挥的作用，本文探究了从加拿大安大略省圭尔夫市市政污水处理厂的三级旋转生物反应器（RBC）收集的生物膜样品中硝化螺菌，氨氧化古细菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）的分布，本研究综合利用了qPCR，16S rRNA基因测序和宏基因组学三种手段。研究结果表明，硝化螺菌在RBC微生物群落中占主导地位，而且全程氨氧化细菌数量超过所有其他硝化菌。从组装的基因组中得到的基因组箱揭示了全程氨氧化细菌的多个种群，它们具有独特的时空分布，包括一些与以前表征的硝化螺菌菌群不同的类群。与之前同一RBC生物膜培养并仅检测到氨氧化古生菌的结果相反，多样化的功能图谱暗示了全程氨氧化细菌较高的生态异质性。本研究中宏基因组分箱还揭示了两个编码氰化酶的全程氨氧化细菌种群，它们可降解氰酸盐，这一功能仅在几个具有严格的亚硝酸盐氧化作用的硝化螺菌中发现过。该研究证明RBC作为模型反应器对于研究驱动AOA,AOB和全程氨氧化细菌以及其他亚硝酸盐氧化菌的分布和活性的环境因素的重要性。
论文ID
原名：High functional diversity among Nitrospira populations that dominate rotating biological contactor microbial communities in a municipal wastewater treatment plant
译名：消化螺菌群的功能多样性主导着污水处理厂生物反应器中的微生物群落
期刊：The ISME Journal
IF：9.493
发表时间：2020.03
通讯作者：Josh D. Neufeld
通讯作者单位：滑铁卢大学生物系
实验设计
本文以加拿大安大略省圭尔夫市的污水处理厂的第三级旋转生物反应器（RBC）作为采样点（图1A）。该反应器由4个部分组成（分别为NW,NE,SW和SE），每个部分又有8个独立的流程（分别为RBC1,RBC2,RBC3…RBC8）（图1B）。本文于2016年10月利用乙醇消毒后的刮刀收集了每个流程中形成的微生物膜，其中SE的RBC1和SW的RBC2没有进行采样。采集微生物的同时本文还测定了RBC1和RBC8进水中铵、亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。此外，本文中的微生物样除2016年收集的之外，还有分别于2010年2月，6月和9月NE的RBC1和RBC8中进行收集的微生物膜。
图1 污水处理厂的旋转生物反应器。（a）生物反应器的外部视图，（b）反应器内部流程。箭头表示水流方向。（c）在2016年10月采集生物膜的同时，在RBC进水中采样了铵（NH4 -N），亚硝酸盐（NO2-N）和硝酸盐（NO3-N）浓度。误差线表示技术重复的标准偏差。NE，NW，SE，SW分别表示东北、西北、东南、西南四个生物反应器。
所有微生物膜用PowerSoil DNA试剂盒进行DNA的提取，然后建立宏基因组数据库，构建16S rRNA V4-V5文库。其中RBC1和RBC8的DNA用于16S rRNA基因和宏基因组测序，而qPCR分析了2016年和2010年采样的所有RBC的DNA提取物，使用特定引物分别对亚硝化球菌的16S rRNA基因、细菌的16S rRNA基因、全程氨氧化细菌进化枝A和B的amoA基因进行定量。
结果
总的来说，硝化菌群落组成在空间（RBC1和RBC8）和时间（2010年和2016年）上都有所不同。在每个RBC流程中，RBC1中全程氨氧化细菌基因的相对丰度以及在整个群落中全程氨氧化细菌的比例都始终高于RBC8（图2），这一趋势和进水中铵浓度变化相一致（图1c）。对于大多数样品和时间点，全程氨氧化细菌的amoA基因比其他氨氧化菌的基因丰度更好（图2）。除了全程氨氧化细菌外，qpcr的结果还显示，2010年样本中RBC8中与亚硝化球菌相关的16S rRNA基因的相对丰度比RBC1中更高。相反，2016年的样本中，四个部分RBC1中亚硝化球菌相关的16S rRNA基因菌高于RBC8中，且其丰度与全程氨氧化细菌amoA基因丰度相当（图2）。从时间维度来看，尽管RBC1中AOB amoA基因的丰度均高于RBC8的，但这些基因的丰度2016年比2010年低了一到两个数量级。
图2 细菌的16S rRNA，全程氨氧化细菌（amoA），AOB（amoA）和亚硝化球菌特异性的16S rRNA基因丰度很高（图中样品与宏基因组测序的样品一致）。误差线表示重复样品的标准偏差。饼形图显示了基因丰度占所有氨氧化原核生物的比例。饼状图上方的数字表示所有氨氧化原核生物所代表的总群落比例（％）。基因拷贝数是根据原始提取物中存在的DNA量计算得出的，但尚未标准化以说明每个基因组的预期基因拷贝数。NE，NW，SE，SW分别表示东北、西北、东南、西南四个生物反应器。
尽管16S rRNA基因无法区分全程氨氧化细菌和严格的亚硝酸盐氧化菌，但硝化螺菌扩增子序列变体（ASV）的总体相对丰度变化（图3）与qpcr的结果相一致（图2），每个样本中RBC1中的硝化螺菌的相对丰度高于RBC8中的。相对丰度>1%的8个ASV均隶属于硝化螺菌（图3），这些硝化螺菌ASV在RBC微生物膜样品中中主导地位（图3）。另外还有5个相对丰度>1%的ASV隶属于亚硝化杆菌科，但与亚硝化单胞菌属相关的4个ASV仅在2010年出现。此外，qpcr和ASV数据均表明2016年的微生物中AOB丰度较低。
图3 基于16S rRNA基因扩增子测序的扩增子序列变体（ASV）的相对丰度（与宏基因组测序的样品一致），仅显示相对丰度≥1％的分类群，物种注释水平为最低的信息分类学等级。下划线后的数字是ASV编号，圆圈内的数字表示相对丰度（百分比）。硝化螺菌 ASV用橙色突出显示，AOB ASV用绿色突出显示，而AOA ASV用蓝色突出显示。
未组装的宏基因组序列数据的单拷贝分类标记基因分析与qpcr和16S rRNA基因序列数据一致，均表明硝化螺菌在所有样品中占优势地位，并且在两个采样年的RBC微生物样本中占总rpoB基因序列的8%到32%（图4）。所有样本均显示，RBC1中的硝化螺菌相关的rpoB基因的相对丰度均高于RBC8。此外，全程氨氧化细菌的amoA基因的标准化后的相对丰度与根据qpcr数据计算出的amoA基因在RBC微生物群落中的相对丰度有较强的相关性（Spearman相关性，rs=0.79，P<0.001）。
图4 通过隐马尔可夫模型（HMM）对RNA聚合酶β亚基（rpoB）进行生物反应器（RBC）微生物群落的分类分析。堆积的条形图表示属水平上的未组装的rpoB宏基因组序列的相对丰度。图中显示了相对丰度≥1％的属。深橙色和绿色阴影的条表示硝化菌。硝化螺菌种包括严格的亚硝酸盐氧化和全程氨氧化细菌，因为它们在属水平上无法区分。 NE，NW，SE，SW分别表示东北、西北、东南、西南四个部位的生物反应器。
未组装的序列数据中检测到的功能基因标准化后的相对丰度，可以使我们进一步估计硝化菌群微生物的相对贡献。假设每个基因组有一个amoA基因拷贝，根据标准化的amoA HMM覆盖结果，对于所有样品，全程氨氧化细菌占总微生物群落的约5-30％（图5b）。硝化螺菌相关的rpoB和标准化的amoA基因丰度相似（图4、5b），表明存在于RBC中的大多数硝化螺菌是全程氨氧化细菌。HMM对nxrB / narH的覆盖结果显示，与该模型相关的序列在RBC生物膜宏基因组中也很普遍，覆盖度超过50％的丰度被归一化为总rpoB覆盖率（图5c）。HMM搜索AOA的amoA基因同样显示出在宏基因组数据集中较低的相对丰度（图5a）。对于2010年的样本，与亚硝化细菌相关的amoA基因序列在RBC 8中比RBC 1样本更为丰富；而在2016年，除NE样本外，在RBC 1中amoA基因序列比RBC 8样本中更加丰富。未组装的宏基因组序列中AOA amoA基因的HMM覆盖率较低，所有样本的HMM覆盖率只有64，但AOA amoA标准化相对丰度仍与qpcr结果中AOA 16S rRNA基因在总群落中的相应比例有相关性（Spearman相关性，rs = 0.67，P = 0.009）。 AOB的amoA HMM检测到了全程氨氧化细菌和AOB的序列。总体而言，在两个采样年中，RBC 1中AOB amoA基因的相对丰度均高于相应样品对的RBC 8（图5b）。
本文还探究了从RBC宏基因组序列数据获得的宏基因组组装基因组（MAGs）的硝化螺菌种群的时间和空间分布。总的来说，除NE1 / NE8（2010年6月）和NW1 / NW8（2016年10月；图6）外，每个样本对的硝化螺菌MAG在RBC 1中的相对丰度均高于RBC 8。同样地，全程氨氧化细菌进化枝A的变化趋势也是如此。同时，个别的硝化螺菌MAG表现出明显的时间和空间分布。具体而言，2010年样本中RBC035，RBC100和RBC069的相对丰度比2016年样本高，2016年RBC001和RBC083的相对丰度通常比2016年高2010年样本（图6）。
图6 基于总贡献序列，各个样本中硝化螺菌的相对丰度。气泡的大小表示映射到每个基因组箱的每个样品的组装序列的比例（％）。堆积的柱形图表征贡献序列到基因组箱中的组装的宏基因组序列的总比例。
除了靶向硝化相关基因以鉴定提取的DNA或未组装的宏基因组序列中的全程氨氧化细菌外，我们还研究了组装和分箱的宏基因组序列数据中的硝化螺菌的多样性。从具有101个基因组箱的最终重复复制数据集中（附表3），挑选出12个MAGs隶属于硝化菌门，它们具有较高的完整性（≥80％）和较低的污染度（<5％；附表6）。利用一组74个核心细菌蛋白，根据传统的硝化螺菌系统发育将这些MAGs进一步分类（图7）。大部分（12个中的8个）硝化螺菌MAGs隶属于全程氨氧化细菌进化枝A（亚类II），三个隶属于亚类I（严格NOB）内，一个（RBC003）隶属于硝化螺菌门的亚谱系IV（严格NOB）中。因此，为简明起见，这12个硝化螺菌门MAGs的集合将被称为硝化螺菌MAGs。硝化螺菌MAG的高度多样性与通过16S rRNA基因扩增子测序检测到的多个硝化螺菌ASV一致（图3）。
图7 硝化螺菌 bins和参考基因组中的系统发育和基因途径。从这项研究中得到的bins以粗体显示，星号表示基因组来自富集或纯培养。使用一组74个核心细菌蛋白进行了系统生物学分析。除显示的值外，所有引导程序值均为100％，并且比例尺表示氨基酸变化的比例。使用互逆BLASTP针对四个参考硝化螺菌基因组（“ Ca. N.inopinata”，Nitrospiramoscoviensis， Lintrospiralenta， Nitrospira japonica）确定基因注释，并在热图中表征与参考基因的氨基酸同一性。氨氨单加氧酶，Rh50氨转运蛋白，氨氨转运蛋白，hao羟胺氧化还原酶，cyc细胞色素c，nxr亚硝酸盐氧化还原酶，尿素酶，urt尿素转运蛋白，nrf细胞色素c亚硝酸盐还原酶，nirK亚硝酸亚硝酸还原酶，nirA同化亚硝酸盐c，亚硝酸盐/硝酸盐转运蛋白，nirC亚硝酸盐转运蛋白，cynABD氰酸盐转运蛋白，cynS氰酸盐水合酶，hup组2a [Ni-Fe]氢化酶，hyp加氢酶辅助蛋白，hyf假定的4组加氢酶，hyb和hyd 3组[Ni-Fe ]还原硫的氢酶，fdh甲酸脱氢酶。
比较有意思的一点是两个包含氨氧化基因的全程氨氧化细菌进化枝A bins（RBC069和RBC093）也编码了氰化酶基因（cynS；图7、8a）。cynS基因位于长重叠群上（即分别为182 kb和121 kb，分别为RBC069和RBC093），并且当使用BLASTP针对RefSeq查询时，与cynS基因相邻的大多数基因的主要序列属于已知的全程氨氧化细菌。这表明在RBC全程氨氧化细菌 MAGs中cynS的存在不是由基因组装分箱错误引起的。全程氨氧化细菌氰化酶是标准NOB 硝化螺菌中所有其他已知氰化酶的基础（图8a）。该基础位置与硝化螺菌的管家基因系统发育不匹配（图7），表明侧向基因转移作为氰化酶获取机制的潜在作用。包含cynS的bins占RBC微生物群落的很大一部分（约10–25％；图8b）。
图8 在RBC宏基因组测序数据中检测到的氰化酶（CynS）系统发育和相对丰富的。 a 与NCBI参考序列相比，本研究在硝化螺菌基因组bins中检测到的CynS一级序列的最大似然系统发育。硝化螺菌进化支的亚谱系由彩色竖线突出显示，包括潜在的全程氨氧化细菌进化支A，并以橙色突出显示。从RBC中得到的基因组bins加粗，在培养微生物的基因组名称后加星号。显示了超过50％的引导值，比例尺代表氨基酸变化的比例。在系统发育的右侧，显示了CynS一级序列比对的一部分以及基于BLOSUM62度量的总体序列相似性。具有100％保守性的残基标有星号。蓝色星号用于标记CynS的已知催化残基，即Arg96，Glu99和Ser122。 b在RBC宏基因组中，所有包含cynS的RBC基因组bins的相对丰度。基因组bins注释到属水平，相对丰度是组装序列与基因组数据的比例（％）。
结果
这项研究使用多种方法来证明全程氨氧化细菌在污水处理厂系统的生物膜中的微生物群落中占主导地位。与同一系统中发现的AOA种群相比，检测到的全程氨氧化细菌显示出较高的分类学水平和功能多样性。在污水处理厂内建立之前，在异质土壤或沉积物样品内，全程氨氧化细菌的进化史可能是造成RBCs内多样性高的一个因素。有一些系统发育证据表明，在RBCs中富集的AOA可能起源于皮肤表面，这将提供相对较低的栖息地异质性。此外，其他研究发现，污水处理厂中紧密相关的硝化螺菌并存，这表明硝化螺菌在工程硝化环境中可能能够占据许多不同的生态位。尽管全程氨氧化细菌在数量上占主导地位，但它们在RBC环境中对硝化的贡献仍不清楚。未来使用差异抑制剂，同位素示踪剂研究和实验室培养的研究可能有助于阐明全程氨氧化细菌对RBC中硝化作用的贡献。
你可能还喜欢