科研 | Nature子刊: 腹泻可引起艰难梭菌长期定殖并反复大量繁殖
编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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普遍认为，艰难梭菌是医院感染中最重要的病原体之一，与抗生素使用有关，但最近的证据表明，这样的描述不够充分。艰难梭菌与胃肠道疾病的关系可能是导致其感染的另一个原因，但是这种肠道疾病与艰难梭菌定植的关系还没有被报道。该研究显示由腹泻引起的干扰触发胃肠道对艰难梭菌定植的敏感性。利用人类肠道微生物群的调查数据，研究人员发现艰难梭菌在食物中毒和霍乱弧菌感染后处于恢复期的人群中大量繁殖。艰难梭菌可以在携带者体内定殖长达一年，并且其丰度表现出高度变化模式，在1-2天内短时间大量脱落，而在脱落终止后一周的时间内无法检测到艰难梭菌。考虑到艰难梭菌短暂的脱落通常与胃肠道紊乱有关，该研究结果有助于解释为什么经常发现艰难梭菌是腹泻患者的一种共感染病原体。为了直接检测腹泻对艰难梭菌定植敏感性的影响，研究人员开发一个可改变胃肠道紊乱程度的小鼠模型，该模型能够在没有疾病的情况下监测细菌定植情况。随着接触无毒性艰难梭菌孢子的小鼠摄入越来越多的泻药，更多的小鼠表现有艰难梭菌大量繁殖。结果表明，在急性疾病发生后的几天内，艰难梭菌定植的可能性最高，表明这几天可能是重要的时期，可以在此期间阻止艰难梭菌传播，降低感染的发生率。
论文ID
原名：Diarrhoeal events can trigger long-term Clostridium difficile colonization with recurrent blooms
译名：腹泻引起艰难梭菌长期定殖并反复大量繁殖
期刊：Nature Microbiology
IF：14.3
发表时间：2020.2.10
通讯作者： Martin F. Polz
通讯作者单位：美国麻省理工学院土木与环境工程系
实验设计
首先基于DNA测序的方法对David以及Hsaio等人的两项研究进行时间序列分析，确定胃肠道紊乱是否会引起艰难梭菌定植。为了直接测试腹泻对艰难梭菌定植的影响，开发一种不受艰难梭菌发病机制影响的可调节胃肠紊乱强度的小鼠模型。喂养四组小鼠，每组十只，在接触艰难梭菌时增加泻药，在开始前3d一直到泻药处理后第10天每天进行粪便取样，并使用16S rRNA测序监测粪便中是否存在艰难梭菌。第10天收集回肠、盲肠、升结肠和回肠交界组织进行组织学分析。
图1.艰难梭菌的定殖和大量繁殖与腹泻病的恢复有关。
结果
为了确定胃肠道紊乱是否会引起艰难梭菌定植，搜索有关肠道微生物组的调查，这些调查的时间清晰且具有较高的腹泻发病率，且腹泻发生都不是抗生素治疗引起的。我们关注的是基于DNA测序的微生物群落图谱，而不是基于培养的分析。具体来说，我们发现一种广泛使用的DNA提取方案，使用二氧化硅珠进行机械裂解和DNA纯化，这种方法对艰难梭菌营养细胞的效率大约比孢子高800倍。David等人进行一项时间序列研究，对两个成年人进行长达一年的采样(分别为291和159个样本)，重新分析该研究揭示艰难梭菌定植和脱落的增加与腹泻紊乱之间的关系(图1)。研究参与者B在前151天未检测到艰难梭菌，但在食物中毒引起的腹泻未得到治疗后的第2天艰难梭菌数量急剧增加，表明其在此期间发生了艰难梭菌定植。研究参与者B在发病18天后再次出现胃肠道紊乱，检测它们粪便发现有艰难梭菌大量繁殖。同样，研究对象A出国旅行时感染了腹泻后没有使用抗生素治疗，立即有大量艰难梭菌在其体内定殖。值得注意的是，这两个人都没有意识到他们在这段时间里被艰难梭菌定殖。
对David等人的30项研究重新分析也揭示艰难梭菌传播的短期和长期动态。艰难梭菌定植研究参与者B后，在他们的粪便中存留了64天。研究参与者A在取样的最初几天检测到艰难梭菌，表明开始便有该菌定殖，在随后的365天研究中同样持续存在。艰难梭菌的丰度每天都有很大的变化。虽然艰难梭菌在繁殖期间的丰度在0.02和0.05%之间，但这些丰度在有症状患者的丰度范围内。虽然研究参与者B经历的两次定殖都与肠胃紊乱有关，研究参与者A却不是绝对的表现这种关系。分析研究参与者日常粪便频率和稠度的元数据显示，研究参与者A所经历的七次艰难梭菌大量繁殖中，只有一次大量繁殖之前大便更频繁、更松弛。综上所述，这些观察表明，在长达一年的时间内艰难梭菌可持续在肠道定殖，但在这段时间内其数量变化很大，可能与第二次腹泻发生有关。
接下来，分析Hsaio等人的时间序列，采集孟加拉国7名求治霍乱弧菌感染患者的粪便样本。在治疗感染的过程中收集他们的每一次排便，在第一次排出固体大便后允许出院。前两周每天对研究参与者采集样本，之后每周采集一次，研究参与者最初接受单次口服阿奇霉素，然后在整个住院期间接受补液治疗。7名研究参与者在感染期间都表现出类似的群落转变模式，即从一个以变形杆菌为主的群落向以厚壁菌门和拟杆菌门为主的健康状态转变(图2)。此外，7名研究参与者在康复阶段，无论是出院前还是出院后几天都有艰难梭菌大量繁殖。具体来说，每个研究参与者都出现艰难梭菌数量的突然峰值，占总菌群的0.2-4.3%，比其他时期的平均数量高1到3个数量级。甚至在出院几个月后，所有七名研究参与者的粪便中都检测到艰难梭菌。这些观察提供进一步的证据，艰难梭菌在肠道内存活的时间较长，在急性感染后的早期恢复阶段是决定其是否容易定殖的关键时期。
虽然7名霍乱弧菌感染患者接受单一剂量的阿奇霉素，但不太可能对艰难梭菌定植有实质性的影响。对患者抗生素使用和CDI发生率的荟萃分析表明，使用大环内酯类抗生素，包括阿奇霉素，发生CDI 的风险较低。但是，我们从婴儿使用阿奇霉素的一项随机安慰剂对照试验中，对粪便的16S rRNA测序数据进行了重新分析，以更直接地评估阿奇霉素对无症状艰难梭菌定植的影响。婴儿是研究无症状艰难梭菌传播的特别有用的队列，因为相比成年人它们更容易被定植，但很少出现疾病症状。在阿奇霉素处理3天之前和之后两周，收集120名研究参与者粪便样本，共有29名研究参与者在研究中的某个时间点被艰难梭菌定殖（17个阿奇霉素，12个安慰剂），但与安慰剂组的研究参与者相比，在开始都呈艰难梭菌阴性的情况下，接受阿奇霉素治疗的研究参与者感染艰难梭菌的可能性并没有增加。对于治疗前艰难梭菌阳性的研究参与者，阿奇霉素组的艰难梭菌含量增加，降低或降至检测限以下的可能性与安慰剂组相同。考虑到霍乱弧菌感染引起严重的胃肠道紊乱，导致在Hsaio等调查的7例患者粪便中，肠上皮和粘膜的碎片清晰可见。每小时排便0.7次-3.5次很可能是艰难梭菌定植敏感性的主要因素，而不是使用阿奇霉素。
图2.艰难梭菌在感染霍乱弧菌后恢复的病人中繁殖。
顶部的图表总结随时间推移粪便微生物群落的科水平系统发育结构。同一颜色的不同色度代表同一门的不同科。下图显示艰难梭菌在整个研究中的相对数量。
图3.与安慰剂对照组相比，阿奇霉素治疗对婴儿艰难梭菌定植无明显影响。
a 两组粪便仍为艰难梭菌阴性的比例，两组研究参与者在最初为阴性后变为艰难梭菌阳性或在最初为阳性后变为艰难梭菌阴性。在这些类别中，用阿奇霉素治疗的研究参与者的人数与安慰剂组在统计学上没有差异。b.研究参与者在12d的治疗后较治疗前艰难梭菌丰度发生成倍的变化。在研究参与者中阿奇霉素组与安慰剂组一样，在治疗前和治疗后艰难梭菌的数量都有可能增加或减少。
为了确定健康的人如果没有胃肠紊乱的情况是否会有艰难梭菌定殖，我们接下来搜索关于没有腹泻的人的一些微生物组的最近研究。首先确定了Caporaso等人的一项研究。一年的时间，研究人员分别对两名成年人的粪便、舌头和手掌进行332次和130次采样，两名研究对象都没有出现腹泻症状。分别在两个不同的研究参与者的手掌上检测到艰难梭菌，我们可以推断，这些研究参与者在日常活动中偶尔会接触到艰难梭菌。然而，没有在这两个人的粪便中检测到艰难梭菌，表明尽管他们反复接触艰难梭菌但都没有被感染。
美国国立卫生研究院人类微生物组计划健康队列用更多研究参与者测试健康人是否有艰难梭菌定殖。30多项排除标准确保所有的研究参与者都是健康的。这些标准可以排除在取样前6个月使用抗生素、有胃肠道疾病或急性疾病史的研究参与者。分别对286名研究参与者采样三次，共603个样本。只在一个样本中检测到艰难梭菌(相对丰度为0.001%)，这个样本来自一名被取样三次的研究参与者，表明艰难梭菌在健康人群中很少见。
尽管在人身上观察到的结果令人信服，但最终无法排除不受控制的因素影响到观察结果。为了直接测试腹泻对艰难梭菌定植的影响，我们开发一种可调节胃肠紊乱强度的小鼠模型，该模型不受艰难梭菌发病机制影响。我们喂养四组小鼠，每组十只，在接触艰难梭菌时增加渗透性泻药，并通过16S rRNA测序检测粪便中是否存在艰难梭菌。处理结束时，对照组(第1组;0 mg/ml PEG3350)有坚硬、成形良好的粪便颗粒；2组(15mg/ml PEG3350)粪便颗粒柔软、成形良好；3组(30 mg/ml PEG3350)粪便颗粒柔软，但无水样；第4组(150 mg/ml PEG3350)出现稀水便。第1组至第3组观察到行为和体重减轻均无明显变化，但第4组小鼠变得不活动，平均体重减轻其初始体重的6％。第10天收集回肠、盲肠、升结肠和回肠交界组织的组织学分析显示，四个小组共40只小鼠均无炎症症状，即每只小鼠以炎症五分制计算均为零分。因此，这些观察结果表明，处理组近似轻度腹泻(组2)，强腹泻(组3)和急性腹泻(组4)，但在所有小鼠中均未出现持续性肠道炎症。
通过增加饮用水中泻药的浓度，在小鼠粪便中发现艰难梭菌的繁殖速度和数量都增加(图4)。对照组和最低泻药剂量处理组(第2组)的小鼠粪便中均未检测到艰难梭菌。然而，第3组的一只老鼠和第四组的八只老鼠粪便中有艰难梭菌繁殖，这种情况持续三天。通过检测微生物群落的整体变化，艰难梭菌的丰度也随着腹泻引起的胃肠道紊乱程度的增加而增加。重要的是，PEG3350处理后，在粪便的稠度和总体细菌丰度恢复正常后出现艰难梭菌大量繁殖。该观察结果表明，这些繁殖代表着艰难梭菌数量的绝对增加，而不是由于样品细胞密度不均匀而测量到的相对丰度。此外，从细菌大量繁殖的小鼠粪便样本中培养艰难梭菌，并证实这些分离出的细菌的基因型与添加到饮用水中的孢子相同。艰难梭菌的培养丰度与16S rRNA序列测定的丰度基本一致。在将艰难梭菌孢子添加到水里之前以及PEG3350处理后的小鼠中，无法分离出任何其他艰难梭菌菌株。表明在处理之前不存在艰难梭菌污染，且检测到的大量定殖的艰难梭菌是所接种的艰难梭菌菌株。我们还无法在小鼠的16SPIP数据库中找到与任何病原体相对应的16S rRNA序列，表明不存在偶然感染影响艰难梭菌的定殖。总的来说，这些结果表明，泻药引起的胃肠道紊乱使小鼠更容易感染艰难梭菌，证实了从腹泻病患者身上观察到的情况，即胃肠道紊乱后几天是艰难梭菌易感的关键时期。
图4.增加干扰强度导致艰难梭菌在小鼠中繁殖的可能性和程度增加。
每组中小鼠粪便有艰难梭菌繁殖的小鼠数量。b. 干扰程度的大小，以相对于治疗前3 d每只小鼠在第1天的粪便微生物群落之间的平均Bray Curtis差异来衡量。c. 随时间变化的粪便微生物群落的科水平系统发育结构（上图），以及随时间推移每只小鼠中艰难梭菌的相对丰度（底部）。
讨论
像克林霉素这样的抗生素可以破坏肠道的屏障功能，改变肠道的物理和化学性质，使人们容易受到CDI的影响。我们证明，这一关系比先前认为的更为普遍，因为腹泻引起的胃肠道紊乱可引发对定殖的敏感性，而不论其病因如何。我们的观察证明对于艰难梭菌是医院感染中最重要的病原体之一，与抗生素使用有关的描述不够完整。我们的结果表明艰难梭菌是一种与干扰有关的机会主义者，其定植与胃肠道疾病的病史有关。
我们的分析强调，敏感性的关键时期在紧接着干扰之后的几天，即恢复期。七名从霍乱感染中恢复的研究参与者中，有四人在住院期间第一次排出固体状粪便时出现艰难梭菌大量繁殖(图2)。剩下的三名研究参与者在出院后几天内经历艰难梭菌繁殖。同样地，所有的小鼠在泻药处理的前2天内出现第一次艰难梭菌繁殖。因此，腹泻后几天是阻断艰难梭菌传播周期的一个重要目标。
长期时间序列研究分析揭示艰难梭菌的传播可以在长达一年的时间尺度内持续存在，脱落量在这段时间内大幅波动(图1)。特别是在携带者中第二次紊乱不断触发短期艰难梭菌大量脱落。这种与腹泻的联系突出在胃肠道紊乱后针对此时期阻断艰难梭菌传播的重要性。然而，并非我们检测到的所有艰难梭菌继发感染都与腹泻病有明显的关联，表明一旦有人感染艰难梭菌，除了肠胃紊乱外，其他因素也会引发艰难梭菌大量脱落。随着时间的推移，艰难梭菌在携带者体内高度可变的丰度也对诊断有重要意义。艰难梭菌在同一时间内往往会在检测限度以下波动几天，揭示单时间点诊断是否为携带者不可靠。
虽然在小鼠模型中观察到各种干扰强度下艰难梭菌的繁殖都是短暂的，但艰难梭菌的数量可能只是低于检测限度。我们对人类的观察表明，这种丰度是高度可变的，常常几天内都低于检测的极限。事实上，Lawley等人的一项研究表明，在小鼠体内，由克林达霉素诱导的艰难梭菌定植在初始定植过程中也产生了类似的繁殖-脱落动态，艰难梭菌的丰度最初很高，但几天内就陡然下降了6个数量级，达到检测的极限。但是，随后对相同小鼠进行抗生素处理可能会在30 d后引起艰难梭菌二次繁殖。因此，有可能在泻药处理后出现艰难梭菌繁殖的小鼠细菌定殖变得稳定，但我们的模型系统中艰难梭菌的稳态丰度低于16S rRNA测序的检测限度。
观察到胃肠道紊乱会引起携带者体内艰难梭菌短暂的脱落，有助于解释为什么通常认为艰难梭菌是一种共感染病原体。最近，医学实验室开始使用独立培养的检测方法，同时检测数十种不同的病原体，表明腹泻患者中同时感染的情况非常普遍。大约10%的腹泻患者检测出多种胃肠道病原体呈阳性，其中40%的病例将艰难梭菌确定为共同感染源。然而，还不清楚艰难梭菌是否是这些患者疾病的驱动因素。我们的研究结果表明，许多这些共感染患者可能是无症状携带者，而导致他们症状的继发性感染导致艰难梭菌脱落。如果这是真的，可能意味着由艰难梭菌引起的实际患病率低于目前的估计。
腹泻可能足以刺激艰难梭菌的易感性，但在本研究中被确定为长期携带者的9名研究参与者没有人出现症状。可能表明，引起疾病发展的因素与促进定植的因素是分开的。大多数抗生素与灌肠或服用大便软化剂引起的CDI相对危险升高相似。但是克林霉素，氟喹诺酮类和头孢菌素类抗生素发展为CDI的风险大大增加，由于抗生素引起的常见副作用是腹泻，因此许多抗生素可能通过引起肠道紊乱而促进对定植的敏感性。然而，只有少数抗生素也会影响肠道的物理、化学和微生物特性的变化，从而影响疾病的进展，比如改变结肠中的胆汁酸成分。
确定长期携带者多久出现一次症状或成为其他人的感染源非常重要。有证据表明，艰难梭菌定植降低发展CDI的可能性，特别是如果该菌株不产生毒素。但是，如果定殖菌株来自艰难梭菌的高毒力进化枝，则如果肠道条件发生变化，这些携带者就可能转变为疾病状态。事实上，大多数无症状的艰难梭菌携带者都携带有致毒性菌株。即使无症状携带者人不太可能发生CDI，无论定植的基因型如何，反复大量繁殖并伴随着脱落模式的增加表明这些携带者是艰难梭菌传播的重要驱动力。我们的结果表明，未来的干预措施需要更加认真地考虑非抗生素引起的胃肠道紊乱在艰难梭菌传播周期中的作用。我们的分析强调在腹泻发生后的几天内确定具体传播时期的重要性。在美国，每年约有4800万人感染食源性疾病，着重强调此类疾病发生后的几天，将其作为降低艰难梭菌患病率的重要目标。在此期间开发新的药物或生物疗法以增加定殖抗性可能是实现这一目标的重要一步。
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