小鼠巨噬细胞的原代分离培养方法

培养板的包被

（1）将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，洗涤剂浸洗、烘干。

（2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。

（3）用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

小鼠巨噬细胞的分离及培养

(1) 实验开始前向小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白a的磷酸盐缓冲液（PBS）。

(2) 3天后，断颈处死小鼠，75%酒精消毒小鼠皮肤。

(3) 置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

(4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 无菌PBS液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

(5) 用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

(6) 小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液，重复两次，加入完全培养液重悬。

(7) 将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以 400µl/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24 孔培养板或 100µl/孔接种 96 孔培养板。

(8) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，细胞培养24-48 h直到融合。