科研 | Plant Science: 综合转录组和蛋白质组学分析构建油松雌性不育系胚珠败育的分子模型
编译：凉风月，编辑：十九、江舜尧。
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胚珠作为植物雌配子的载体，是进行雌配子体形成、受精、胚胎发生和种子发育等有性生殖基本过程的场所。胚珠的形成和发育在二倍体和单倍体交替发生的植物生活史中占有中心地位，是植物繁殖的关键，其中大配子体游离核有丝分裂(FNMM)对胚珠发育至关重要。然而，大多数胚珠发育的结果都是基于被子植物的研究，在裸子植物中，尤其是在FNMM期间，它的分子调控机制仍不清楚。在此背景下，研究者利用转录组学和蛋白质组学相结合的方法，研究油松(Pinus tabuliformis Carr.)亲缘关系密切的不育系(SL)和可育系(FL)胚珠的基因组差异。结果发现：与DNA复制、DNA损伤修复、细胞周期、凋亡和能量代谢相关的基因显著表达。进一步的结果显示MCM2-7、RRM1等基因低表达，PARP2、CCs1、CCs3等基因表达有显著差异，表明SL胚珠中积累的DNA双链断裂不能被修复，细胞周期阻滞在G2/M（DNA合成后期/分裂期）期，有可能导致细胞凋亡。此外，电子转移黄素蛋白：泛醌氧化还原酶（ETF-QO）的不足可能阻碍了FNMM的发展。因此，在SL胚珠中，FNMM停止，胚珠败育。研究者认为，油松FNMM半停顿和胚珠败育可能是一种选择性调控机制，对于研究木本裸子植物胚珠发育的分子调控有重要意义。
论文ID
原名：Integrative transcriptomics and proteomics analysis constructs a new molecular model for ovule abortion in the female-sterile line of Pinus tabuliformis Carr.
译名：综合转录组和蛋白质组学分析构建油松雌性不育系胚珠败育的分子模型
期刊：Plant Science
IF：4.22
发表时间：2020.5
通讯作者：郑彩霞
通讯作者单位：北京林业大学生物科学与技术学院
DOI号：10.1016/j.plantsci.2020.110462
实验设计
研究者从辽宁省兴城油松种子园采集了油松FNMM早期的FL胚珠（FLe）和SL胚珠（SLe），以及油松FNMM晚期的FL胚珠（FLl）和SL胚珠（SLl）作为4个样品，每个样品含9个球果的10个胚珠，其中至少对3个胚珠进行石蜡切片，进行显微镜观察以确定它们的发育阶段；每个样品混合9个球果的数十个胚珠，放置在液氮中过夜，然后在-80℃中保存，用于转录组测序（De novo）和蛋白质组学（iTRAQ-2DLC-MS/MS）研究。同一参考基因的mRNA和蛋白质表达是相关的。当一个基因在mRNA和蛋白质水平上都能被检测到时，该基因的mRNA和蛋白质被认为是相关的。据此，研究者建立了差异表达转录本（DETS）和差异表达蛋白质（DEPs）的相关数据库，即相关差异表达基因(cor-DEGs)数据库，进行后续分析。
结果
1.转录组和蛋白质组学数据概述
研究者将冻存胚珠样本进行RNA提取、处理，得到4个文库，使用Illumina HiSeqTM2000(Illumina，CA，USA)对文库进行测序，共获得63449个转录本(30276个在FLe中，34088个在FLl中，32685个在SLe中，34189个在SLl中)。取冻存胚珠，液氮研磨提取蛋白质，处理后经iTRAQ、质谱和定量分析，共鉴定出4192个蛋白质，其中FLe为4139个，FLl为4155个，SLe为4144个，SLl为4159个。基因共表达的总结如图2a所示。根据筛选标准和mRNA与蛋白质表达的相关性，在四个有效比较中，总DET、DEPs和cor-DEGs、上调的DET和DEPs、下调的DET和DEPs以及在mRNA和蛋白质水平上趋势相同和相反的cor-DEG的数目如图2b所示。
2.转录组和蛋白质组数据的相关性
为了进行综合分析，研究者对转录组和蛋白质组数据进行了相关性分析，将数据分为三类：所有量化蛋白及其同源mRNA，在mRNA和蛋白质水平上趋势相同和相反的对应蛋白。首先，通过4次比较(SLe_VS_FLe为4122个，SLl_VS_FLl为4147个，FLl_VS_FLe为4129个，SLl_VS_SLe为4132个)将所有定量蛋白质与其同源mRNA进行匹配，并观察到弱相关性，r值(皮尔森相关系数)在SLe_VS_FLe的0.082到SLl_VS_SLe的0.344之间(图A.1)。此外，共有192个cor-DEGs，其中SLe_VS_FLe基因37个，SLl_VS_FLl基因85个，FLl_VS_FLe基因73个，SLl_VS_SLe基因73个(表A.3)。DEPs与相应的DET之间存在相关性(r=-0.872、0.602、0.573和0.358)，在两个水平上具有相同或相反的趋势(图A.1)。
3.GO富集因子和KEGG注释分类
在GO功能和KEGG途径注释以及GO和KEGG富集分析(表A.3、A.5和A.6)之后，在四个比较中(图3a)进行了cor-DEGs的GO富集因子分析。以P<0.0001为阈值，确定了相应的GO项，并结合富集因子(RF)进行了选择。图3a显示了在FNMM期间显著丰富的一组核心GO术语，包括MCM复合体(Rf=1)、参与复制的DNA解离 (Rf=1)、DNA依赖的DNA复制起始的调节(Rf=0.86)、3’-5’DNA解旋酶活性(Rf=0.67)、FLl_VS_FLe中的DNA复制起始(Rf=0.67)和染色体凝聚(Rf=0.60)，以及MCM复合体(Rf=1)、参与复制的DNA解旋(Rf=1)。SLl_VS_SLe的3'-5’DNA解旋酶活性(Rf=0.78)和DNA复制起始活性(Rf=0.67)均与DNA复制和损伤修复有关。
此外，基于每个KEGG项的KEGG主类和子类，在FLl_VS_FLe和SLl_VS_SLe的比较中进行了KEGG注释分类分析(图3b)。以P<0.05为阈值，识别cor-DEG的KEGG通路，并结合RF进行选择。图3b显示最丰富的两个KEGG亚类是“复制和修复”和“细胞生长和死亡”，其中与DNA复制、碱基切除修复、错配修复、核苷酸切除修复、同源重组、细胞周期和凋亡相关的相关基因在FNMM期间在FL和SL之间受到不同的调控。在FNMM期间，FL和SL之间存在着与DNA复制、碱基切除修复、错配修复、核苷酸切除修复、同源重组、细胞周期和凋亡相关的差异调控。GO富集因子和KEGG注释分类分析的结果表明，在FNMM早期和晚期，与DNA复制和损伤修复、细胞周期调节和凋亡相关的过程高度活跃，且差异显著。
4.Cor-DEGs的表达模式和共表达网络
从cor-DEGs中筛选出52个带有KEGG途径注释的cor-DEGs。cor-DEGs根据它们的KEGG子类注释被分成几组。如图4a所示，与“复制和修复”相关的基因数量最多，并且它们的表达模式基本相同。在mRNA水平上，FNMM早期两个品系间差异不大，直到后期，FL中大部分DET的表达均低于SL。但在蛋白质水平上，FNMM早期两个品系间差异不显著，而到后期，FL的DEPs表达量高于SL。cor-DEPs在“细胞生长与死亡”和“核苷酸代谢”亚类中也出现了相同的表达模式。在此基础上，利用52个对应关系构建相互作用矩阵，计算度值，构建共表达网络。cor-DEGs的度值和共表达网络分别如图4b所示。在本研究中，度值是一个cor-DEG拥有的边数。cor-DEG点面积越大，度值越高，表明该基因与其它基因的关联性越强，在网络中的作用越重要。结果表明，与“遗传信息加工”相关的相关因素度值最高，与“代谢”相关的相关因素次之。KEGG中的“遗传信息处理”途径包括DNA复制、碱基切除修复、错配修复、核苷酸切除修复和同源重组，“代谢”途径包括嘧啶代谢和嘌呤代谢。因此，与DNA复制和损伤修复相关的cor-DEGs在两个品系之间的表达存在显著差异，其中包括KEGG途径的显著表达。
5.四种比较中靶基因在mRNA和蛋白质水平的表达
与DNA复制和损伤修复相关的cor-genes有MCM2-7(微染色体维持蛋白2-7、comp340147_c0、comp332326_c0、comp348338_c0、comp356548_c1、comp357411_c0、comp345223)。与DNA复制和损伤修复相关的cor-基因有MCM2-7(微染色体维持蛋白2-7、comp340147_c0、comp332326_c0、comp348338_c0、comp356548_c1、comp357411_c0、comp345223。POLE2(DNA聚合酶ε亚基2，comp341249_c0)，POLD1(DNA聚合酶δ亚基1，comp332853_c0)，PCNA(增殖细胞核抗原，comp333017_c2)，RFC3(复制因子c亚基3，comp358436_c0)，RPA1(复制子蛋白A 70 kDa DNA结合亚基，comp356245_c2)，RPA2(复制子蛋白A 32 kDa亚基核苷酸水解酶，comp343753_c0)，RNaseH2B(核糖核酸酶H2亚基B，comp326709_c0)，MET1(甲基转移酶1，comp357848)和CMT(染色质甲基酶，comp345322_c0)，与细胞周期调控和凋亡相关的cor-基因有CCs1(凝集素复合体1，comp344053_c0)，CCs3(凝集素复合体3，comp345140_c0)，DNA-PKcs，com332292_c0)和ETF-QO(电子转移黄素蛋白：泛素氧化还原酶，comp348032_c0)与能量代谢有关(图5)。在mRNA水平上，FLe_VS_SLe和FLl_VS_SLl中MCM2-7的表达没有显著差异（FDR>0.01）。SL1_VS_SLe的Log2(FC)分别为4.87(FDR<0.01，MCM2)、5.27(FDR<0.01，MCM3)、5.68(FDR<0.01，MCM4)、5.08(FDR<0.01，MCM5)、3.35(FDR<0.01，MCM6)和5.39(FDR<0.01(MCM7))，高于2.72(FDR<0.01，MCM2)和3.33(FDR<0.01)。FLl_VS_FLe的FDR<0.01(MCM5)为3.23，FDR<0.01(MCM6)为1.72，FDR<0.01(MCM7)为3.39。在蛋白表达水平上，在FNMM的早期和晚期(FLe_VS_SLe和FLl_VS_SLl)，MCM2-7在两个品系之间没有明显的调控，因为它们的表达P值<0.05。而在FNMM早期和晚期，SL(SLl_Vs_SLe)的FC值分别为1.82(MCM2)、1.54(MCM3)、1.65(MCM4)、1.50(MCM5)、1.98(P值<0.05)和1.39(MCM7)，与P值的1.79基本相当或更低，而SLl_VS_SLe组的FC值与SLl_VS_SLe组的FC值无显著性差异(P<0.05)，而SL(SLl_VS_SLe_SLe)组的FC值在FNMM早期至晚期分别为1.82(MCM2)、1.54(MCM3)、1.65(MCM4)、1.50(MCM5)。FLl_VS_FLe分别为1.85(MCM4)、1.95(P<0.05)(MCM5)、2.18(P<0.05(MCM6)和1.38(P<0.05)(MCM7)。
讨论
与DNA复制和损伤修复相关基因
DNA解旋是指双链DNA(dsDNA)在DNA解旋酶的催化下解旋成两个单链DNA(ssDNA)的过程。在真核生物中，DNA解旋酶由MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7组成。它们高度保守，形成一个六角体。在细胞周期的早期G1期，细胞通过由MCM蛋白组成的蛋白质复合物装载到原始DNA上来许可复制起始。在S期之前，许可起始处的MCM2-7可以启动并与复制叉一起移动，提供必要的DNA解旋酶活性。在本研究中(图5和6)，FNMM期间，MCM2-7在FL和SL胚珠中均上调，但SL胚珠中的FCS大于FL胚珠，而MCM2-7在FL和SL胚珠中均上调，但SL胚珠中MCM3-6(或MCM2和MCM7)的FCS低于FL胚珠(或几乎与FL胚珠相似)。相对而言，MCM2-7在SL胚珠中异常过表达，MCM2-7在SL胚珠中表达下调，表明它们不像FL中那样受到抑制，这可能对DNA复制有负面影响。
DNA聚合酶位于细胞核内，在DNA复制中起着重要作用。在DNA 引物酶的复合物中，DNA聚合酶α负责在滞后链中合成冈崎片段，以及在每个复制起点的前导链中的第一个起始事件。POLA1是其大亚基，由ICU2基因编码。此外，δ和ε聚合酶在复制过程中催化合成大量的脱氧核糖核酸。当合成开始时，预起始复合体转变为起始复合体，DNA聚合酶ε作为起始复合体的一部分被加载到DNA复制起点。POLE2是ε聚合酶的第二大亚基，在S期开始时能促进复制复合体的组装并维持其完整性。聚合酶δ是真核生物中的主要聚合酶，是由一个催化亚基和三个辅助亚基组成的异四聚体。POLD1，这个聚合酶的大催化亚基，需要维持某些开花基因的正确的H3K4me3水平，包括FT，SEP3。
DNA引物酶和聚合酶不仅参与DNA复制，而且在DNA损伤修复中发挥作用。研究表明，DNA引物酶在复制偶联DNA修复中起作用，因此有利于染色体的稳定。α聚合酶参与了 植物的基因同源重组。脱氧核糖核酸聚合酶ε在体外可以催化紫外线诱导的脱氧核糖核酸损伤修复，也参与同源重组。DNA聚合酶δ通过DNA从头合成和填充缺口机制参与同源重组途径。在本研究中(图5和6)，FL胚珠PRI1的Fc(2.12，P<0.05)大于SL胚珠(1.89，P<0.05)，FL胚珠的POLA1(1.51，P<0.05)、POLD1(1.54，P<0.05)和POLE2(1.40，P<0.05)显著高于SL胚珠(1.26，P<0.05；1.26，P<0.05；1.19，P<0.05。因此，PRI1、POLA1、POLD1和POLE2在SL胚珠中的表达增量不足，可能不能满足DNA复制的需要，同时也部分影响了DNA的损伤修复。
PCNA为多种蛋白质因子提供了一个结合平台，允许它们参与DNA复制。当DNA复制时，三个PCNAs形成一个环形滑动夹子来协助DNA聚合酶δ。滑动夹子在双链脱氧核糖核酸上自由滑动，并直接与脱氧核糖核酸聚合酶δ结合，从而起到将聚合酶δ固定在脱氧核糖核酸模板上的移动系绳的作用。RFc是一种结构特异性的脱氧核糖核酸结合蛋白，在脱氧核糖核酸复制过程中可以在三磷酸腺苷存在的情况下将增殖细胞核抗原和脱氧核糖核酸聚合酶δ(或ε)装载到模板上。有研究表明，具有胚胎致死表型的AtRFC纯合子突变体的胚和胚乳的细胞分裂受到抑制，表明RFC在拟南芥胚胎发育中可能具有特殊的功能。RFC由5个亚基组成，包括Rfc1、Rfc2、RfC3、RfC4和RfC5。
RFC3与植物的花器官和种子发育相关，并且rfc3-1突变体对DNA复制毒性物质(甲磺酸盐和顺铂)的抗性降低，表明RFC3在DNA损伤修复中具有调节作用。在FNMM早期，两系间PCNA(1.11，P<0.05)和RFC3(1.19，P<0.05)的表达差异不大，但到后期，SL胚珠中RFC3(1.32，P<0.05)的表达显著低于FL胚珠。FNMM中FL胚珠PCNA的FC(1.52，P<0.05)大于SL胚珠(1.44，P<0.05)。相反，FNMM过程中PCNA表达不足和FNMM后期RFC3表达降低可能阻碍了SL胚珠的DNA复制和损伤修复。
RPA是一类单链DNA结合蛋白复合物，由RPA1、RPA2和RPA3三个亚基组成。在DNA复制过程中，RPA参与解离、与单链模板结合并维持DNA的连续复制。当DNA损伤发生时，具有维持、保护和修复染色体结构功能的RPA和蛋白质聚集在损伤部位以检测和修复损伤。在FNMM过程中，FL胚珠中RPA1含量显著增加(1.46，P<0.05)，而SL中RPA1含量无显著变化(0.77，P<0.05)，且FL胚珠中RPA2的Fc(1.50，P<0.05)大于SL中的Fc(1.37，P<0.05)。在胚珠发育后期，RPA1在SL胚珠中的表达(1.53，P<0.05)明显低于FL胚珠。相对而言，RPAs在SL胚珠中表达不足，可能影响DNA复制的启动和延伸，降低DNA损伤修复效率。
DNA甲基化参与转录、DNA复制和DNA损伤修复过程，并由DNA甲基转移酶(DNA MTase)催化。MET1是植物中主要的DNA甲基转移酶，负责维持CG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化。生殖细胞的低甲基化导致开花延迟和胚胎畸形引起的种子不育。DNA(胞嘧啶-5)甲基转移酶CMT是一类重要的植物特异性DNA甲基化酶，其特征是胞嘧啶甲基转移酶催化基序I和IV之间存在染色质组织修饰(Chromo)结构域。在本研究中(图5和6)，FL胚珠中RRM1、CMT、MET1、dUTPase和RNaseH2B的FCS分别为1.99(P值<0.05)、2.04(P<0.05)、2.48(P<0.05)、1.84(P<0.05)和1.66(P<0.05)，高于SL胚珠(1.62,P<0.05、1.80,P<0.05、2.02,P<0.05、1.64,P<0.05和1.48,P<0.05)，而SL胚珠RRM1、CMT、MET1、dUTPase和RNAseH2B的FCS分别为1.99(P<0.05)、2.04(P<0.05)、2.48(P<0.05)和1.64(P<0.05。在FNMM过程中，SL胚珠中CMT(1.51，P<0.05)、dUTPase(1.35，P<0.05)和RNaseH2B(1.35，P<0.05)的表达均显著低于FL胚珠。这说明SL胚珠中DNA复制所需的脱氧核糖核苷酸供应、DNA甲基化、RNA/DNA杂交双链中RNA链的消除以及dUTP进入DNA链的阻止等方面与FL胚珠不同，可能阻碍了正常的DNA复制。结果表明，SL胚珠与FL胚珠在DNA复制、DNA甲基化、RNA/DNA杂化双链中RNA链的消除以及dUTP进入DNA链的阻止等方面存在差异。
与细胞周期调控和凋亡相关的基因
凝集素复合物（CCSS）是由染色体结构维持蛋白(SMC)和其他非SMC蛋白组成的多亚单位蛋白复合物。凝集素复合体在细胞分裂过程中起着染色质凝聚和染色体分离的作用，这对遗传信息的维持和传递非常重要。凝聚素突变体最明显的表型是有丝分裂后期染色体之间大量形成桥梁，这是姐妹染色单体之间连接的错误分辨和有丝分裂后期分离前染色体不正确压缩的结果。分裂后期染色体桥与DNA双链断裂(DSB)有关，双链断裂通常会导致染色体易位或缺失。在FNMM过程中，FL胚珠中CCs1和CCs3的FCS(分别为1.77，P<0.05和2.28，P<0.05)大于SL胚珠(分别为1.42，P<0.05和1.89，P<0.05)，而CCs3在SL胚珠中的表达(1.36，P<0.05)显著低于FL胚珠。这可能导致了SL胚珠细胞DNA双链断裂的异常分布和频率，提示了DSB在SL胚珠中的发生和积累。
DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是一种核丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一种独特的损伤反应元件。它是一个由470 kDa催化亚基(DNA-PKcs)和调节DNA结合亚基Ku异源二聚体(Ku70和Ku80)组成的三蛋白复合体。DNA-PK参与细胞周期调控和细胞凋亡。它主要修复DNADSBs的非同源末端连接，并在维持染色质结构方面发挥作用。从FNMM(FNMM)早期到晚期(FNMM)。5和6)，FL胚珠DNA-PKcs变化不大(0.87，P<0.05)，SL胚珠DNA-PKcs显著增加(1.31，P<0.05)，说明SL胚珠和FL胚珠细胞周期调控不同，DNA双链断裂在同一时间发生。
由PARP催化的PARP2 Poly ADP-核糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，在DNA损伤修复、细胞周期和凋亡中发挥作用。断裂的DNA可以被DNA结合区识别，这个过程会激活PARP。活化的PARP催化合成PAR，并招募DNA修复因子，如DNA聚合酶，聚集在DNA损伤部位，启动修复程序。在PARP2缺陷细胞出现修复烷化剂引起的DNA损伤中的缺陷，潜在地暗示PARP2可能通过形成异源二聚体参与DNA损伤的修复。本研究中(图2)，在FNMM过程中，FL胚珠中PARP2的表达显著增加(1.60，P<0.05)，SL胚珠中PARP2的表达不显著(1.10，P<0.05)，而SL胚珠中PARP2的表达(1.57，P<0.05)显著低于FL胚珠中的PARP2表达。这可能导致DNA修复失败，细胞周期调节异常，SL胚珠细胞可能进行不正确的凋亡过程。
CytC是线粒体膜上的固有蛋白，也是启动线粒体凋亡的关键成分。研究表明，细胞色素C可以在细胞程序性死亡(PCD)的早期阶段从线粒体内膜释放出来，从而触发线粒体凋亡机制。CDC2是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的重要成员之一。在植物中，A型细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKA)是CDC2的同系物，其功能贯穿于整个细胞周期。本研究中(图5和6)，在FNMM过程中，FL胚珠中CDC2的表达显著增加(1.56，P<0.05)，而SL的表达没有显著变化(1.21，P<0.05)，这可能表明FL胚珠细胞在DNA DSB积累的情况下启动了相应的机制来维持细胞周期的正常过程。在FNMM过程中，FL胚珠中CDC2的表达显著增加(1.56，P<0.05)，而SL的表达没有显著变化(1.21，P<0.05)。但在SL胚珠细胞中，相应酶的表达不足，细胞周期紊乱。此外，在FNMM早期，两系胚珠中CytC的表达差异不显著(0.93，P<0.05)，而到后期，SLl中CytC的表达显著高于FLl中的表达(0.77，P<0.05)，这可能表明SL胚珠的细胞周期调控失败，发生了异常的PCD。
与能量代谢相关的基因
电子转移黄素蛋白：泛醌氧化还原酶(ETF-QO，comp348032_c0)是将电子从黄素蛋白转移到泛醌的电子传递链的一部分。它位于最初的脱氢酶和主要呼吸链之间的关键连接，负责物质和能量的新陈代谢。在本研究中(图5和图6)，FL胚珠的FNMM过程中ETF-QO的表达显著增加(2.07，P<0.05)，而SL胚珠中ETF-QO的表达没有显著增加(0.98，P<0.05)，这表明SL胚珠细胞的呼吸和能量代谢可能与FL不同。ETF-QO的表达没有增加，导致能量不足，呼吸提供的能量减少，不能保证FNMM的正常进行。
胚珠败育的可能原因
DNA复制是细胞生长的关键功能，也是修复、重组和转录过程的一部分。有多种细胞DNA修复机制可以去除染色体的受损区域，因为DNA复制错误如果不纠正可能会导致突变。在FNMM期间，参与DNA复制和损伤修复的cor-DEG在两个表达水平或两个株系中上调，包括MCM2-7、PRI1、POLA1、POLE2、POLD1、PCNA、RFC3、RPA1、RPA2、RRM1、dUTPase、RNaseH2B、CMT和MET1(图 6)。但与FL胚珠相比，SL胚珠中相应蛋白的表达量普遍不足。在胚珠发育后期，SL胚珠中大部分蛋白质的表达量显著低于FL胚珠。这些结果表明，FL胚珠的DNA复制和损伤修复正常进行，而SL胚珠可能不正常。在FNMM过程中，SL胚珠细胞可能缺乏DNA损伤修复，从而导致DNA损伤的积累。因此，DNA复制异常和DNA损伤修复减弱可能是油松FNMM半停和胚珠败育的原因之一。
细胞周期是真核细胞自我复制的一种保守机制。它包括一组事件，并且在细胞周期检查点期间监测这些事件的时间和顺序。程序性细胞死亡(凋亡)是一个高度调控的过程，用于从多细胞生物体中清除不需要的或受损的细胞。不受调控的细胞周期可能导致细胞凋亡。在FNMM过程中，参与细胞周期和凋亡的cor-DEGs在SL和FL胚珠中的表达有显著差异。本研究中凝聚素(CCs1，CCs3)的低表达和DNA-PKcs的高表达暗示了DNADSBs在SL胚珠中的积累和细胞周期受阻的事实。DNA-PK激酶活性是DNADSBs在体内修复所必需的，此外，PARP2的不足导致了SL胚珠DNA损伤修复失败，增加了PCD发生的可能性。如果DNA双链断裂不能修复或修复不正确，就会导致染色体异常或细胞死亡。当大量DNA损伤得不到有效修复时，PARP会放弃修复，作为底物参与凋亡过程。此外，CytC和CDC2在两个品系中的表达表明，细胞周期调节紊乱，细胞周期可能无法进入M期，在SL胚珠中可能发生了异常的PCD。这与研究者之前的研究结果一致，即油松雌性SL的FNMM在休眠后结束，相关基因可能参与配子体发育过程中的细胞周期调控。因此，细胞周期调控紊乱、G2-M进程失败和PCD异常可能是油松FNMM半停和胚珠败育的原因之一。
能量代谢对植物的发育非常重要，一些植物的雄性不育与能量代谢密切相关。呼吸作用在能量代谢中占有核心地位，为重要有机物的合成提供物质，也提供能量和还原力。在本研究中，ETF-QO在FL和SL胚珠中的不同表达表明，SL胚珠的呼吸可能比FL胚珠在FNMM过程中提供更少的能量和降低功率。因此，能量供应不足，不能保证油松FNMM的正常进行，可能是造成油松FNMM半停和胚珠败育的原因之一。
结论
综上所述，研究结果表明，由于目标差异基因编码MCM2-7、PRI1、POLA1、POLE2、POLD1、PCNA、RFC3、RPA1、RPA2、RRM1、dUTPase、RNaseH2B、CMT和MET1的低表达，很难保证SL胚珠DNA复制和损伤修复的正常进行，从而可能导致DNA损伤的积累。此外，由cor-DEGs编码的CCs1、CCs3、DNA-PKcs、PARP2、CytC和CDC2在SL胚珠中表达不同，证明了DSB的积累、DNA损伤修复失败和细胞周期调节异常，可能间接导致PCD的发生。此外，ETF-QO的缺乏可能阻碍了需要能量供应的FNMM的各个阶段，可能导致FNMM的失败，最终导致油松雌性不育系的胚珠败育。本研究所提供的转录组和蛋白质组学数据的综合分析将为木本植物大配子体和胚珠发育的功能分析提供有用的候选基因。
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