科研 | 日本香川大学：MicroRNA-210-3p在乙型肝炎病毒相关的肝细胞癌中的作用
编译：小北，编辑：十九、江舜尧。
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肝细胞癌（HCC）是癌症引发死亡的第三个主要疾病，也是全球第五大常见的癌症。尽管肝细胞癌的早期临床治疗已有改观，但是受高复发因素的影响肝细胞癌患者的预后普遍较差。在80%的亚洲人中肝细胞癌是由于乙型肝炎病毒（HBV）感染导致的。现有研究表明多种核酸类似物通过抑制HBV-DNA复制对治疗乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌有作用，但是存活率仍然很低。在临床上乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞癌与肝纤维化分期并不存在必然联系，在肝纤维化分期的早期也是偶尔能够发现。因此寻找新的治疗靶向对抑制乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞癌发生发展至关重要。
MicroRNAs（miRNAs）是一段仅有18到22个核苷基团的非编码RNAs。miRNA的异常表达已经成为人类多种癌症的一个普遍特征。与正常组织相比，肝细胞癌中发现特异的miRNAs的异常表达。因此作者将miRNAs的靶向检测作为乙型肝炎病毒高危的潜在生物标记物，从而预防与癌症相关的死亡。作者收集了从2002-2013年以来进行过肝切除术的29例患者的肝细胞癌组织样品。对样品进行RNA提取后，进行microRNA array，荧光实时定量RT-PCR，组间比较分析（HBV相关的HCC与邻近非癌组织、丙型肝炎病毒（HCV）相关的HCC与邻近非癌组织以及除HBV，HCV相关的其他HCC与邻近非癌组织），同时将HBV阳性的肝细胞癌细胞系检测了特定miRNAs是否与乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌存在功能上的联系。实验结果表明miR-210-3p仅在乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌中的表达水平显著上升，相应的，miR-210-3p的靶基因表达水平降低。在乙型肝炎病毒（HBV）阳性的肝细胞癌中抑制miR-210-3p能够提高靶基因的表达水平。此外，miR-210-3p能够调节乙型肝炎病毒（HBV）感染的Huh-7/NTCP细胞中HBx的表达。研究发现，miR-210-3p的表达升高能够特异的在乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌中检测到，且在乙型肝炎病毒（HBV）阳性的肝细胞癌细胞中能够调节包括HBx在内的多个靶基因。因此，miR-210-3p有望发展成为一种新的乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌检测的生物标记物。
论文ID
原名：The role of microRNA-210-3p in hepatitis Bvirus-related hepatocellular carcinoma
译名：MicroRNA-210-3p在乙型肝炎病毒相关的肝细胞癌中的作用
期刊：American Journal of Physiology- Gastrointestinaland Liver Physiology
影响因子：3.76
发表时间：2020年1月6日
作者：Asahiro Morishita
单位：Kagawa University, Japan
DOI：doi.org/10.1152/ajpgi.00269.2019
结果
miRNA在肝细胞癌及邻近的非癌组织中的表达
作者选取了肝细胞癌的组织以及邻近的非癌组织，通过提取分离组织样本中的miRNA共检测了2755个miRNA的表达谱，层次集群分析（unsupervised hierarchical clustering analysis）结果发现，肿瘤组织样本能够与邻近的非癌组织样本明显分开，且具有显著的统计学意义（图1Figure A，Figure B）。
图1：使用Pearson相关性对表达强度显著不同的miRNA进行了无监督的层次聚类分析。
组间差异分析的结果也显示microRNA-210-3p在乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞癌组织样本中表达水平显著上升，相较于丙型肝炎病毒（HCV）感染的肝细胞癌组织样本、非HBV和HCV感染的肝细胞癌组织样本以及邻近的非癌组织样本（图2）。为了进一步确认microRNA-210-3p在肝细胞癌组织样本中的表达水平，作者通过实时荧光定量RT-PCR进行了检测，结果表明microRNA-210-3p在乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞癌组织样本中表达水平显著上升，相较于丙型肝炎病毒（HCV）感染的肝细胞癌组织样本和非HBV和HCV感染的肝细胞癌组织样本（图3）。
miRNA的表达与临床参数分析
为了进一步将miRNA的表达与临床分析结合，作者分析了临床中的多个参数，结果发现，microRNA-210-3p的表达与病毒的感染（HBV vs. HCV，HBV vs. NBNC）以及组织分化（well differentiated [WD] vs. moderately differentiated [MD]）相关，而与患者的性别、年龄、纤维化分期、肿瘤分期无关，这一结果提示microRNA-210-3p可作为一个新的生物化学标记物用于指示乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞癌的发生发展。
表1：在HCC组织中检测miR-210-3p表达的HCC患者的特征
乙型肝炎病毒（HBV）引起肝细胞癌中，miR-210-3p的表达能够抑制IGF2BP2的mRNA 表达
为了进一步确定miR-210-3p在乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝细胞癌中是高表达，作者利用Alex细胞（乙型肝炎表面抗原阳性的细胞系）和JHH-5细胞（乙型肝炎表面抗原阴性的细胞系）检测了miR-210-3p的表达水平及其靶基因IGF2BP2的表达水平，结果发现miR-210-3p的表达在Alex细胞中显著上升，而IGF2BP2的表达显著降低（图4A）。
图4：A: 在Alex (hbsag阳性)细胞中，miR-210-3p表达上调，与肿瘤进展相关的IGF2BP2表达下调。B: miR-210-3p的抑制增强了Alex (hbs阳性)细胞中IGF2BP2的表达。
为了进一步验证miR-210-3p对下游靶基因IGF2BP2的直接作用，作者在PLC/PRF/5细胞中转染了miR-210-3p的抑制剂，结果表明在PLC/PRF/5细胞中抑制miR-210-3p使IGF2BP2的mRNA水平显著升高。
以上结果均表明由乙型肝炎病毒（HBV）感染导致的miR-210-3p表达可能通过抑制IGF2BP2的表达抑制肝细胞癌细胞的增殖。
在Huh-7/NTCP细胞中miR-210-3p 能够增强乙型肝炎病毒HBV的复制能力replication in cells
为了进一步确定miR-210-3p与乙型肝炎病毒（HBV）复制之间的关系，作者构建了能够稳定表达空载（图5A）和miR-210-3p的Huh-7/NTCP 细胞，通过实时荧光定量RT-PCR（图5B）以及免疫荧光实验（图5C）对转染效率进行了验证。接下来进一步在上述两株细胞系中转染了乙型肝炎病毒（HBV），实时荧光定量PCR实验证实，乙型肝炎病毒（HBV）的mRNA表达水平在miR-210-3p稳转的Huh-7/NTCP 细胞中显著升高。
在Huh-7/NTCP细胞中miR-210-3p能够促进HBx的表达
作者进一步验证了乙型肝炎病毒HBV感染的肝细胞癌中的关键分子HBx的表达水平，利用上述构建成功的稳定表达空载和HBV的Huh-7/NTCP细胞株以及稳定表达miR-210-3p和HBV的Huh-7/NTCP细胞株进行实时荧光定量RT-PCR结果显示，稳定表达miR-210-3p和HBV的Huh-7/NTCP细胞株中HBx的mRNA表达水平显著升高（图6A）。Western blotting实验结果也显示了HBx的蛋白表达水平同样显著升高（图6B）。
以上结果表明由乙型肝炎病毒（HBV）感染导致的miR-210-3p表达参与激活HBx的表达。
结论
作者现有的研究表明miR-210-3p是乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌中唯一表达升高的microRNA，且高表达水平的miR-210-3p能够上调HBx的表达。因此，miR-210-3p有望成为乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌潜在的生物标记物，通过抑制miR-210-3p的表达能够预防与乙型肝炎病毒（HBV）感染相关的肝细胞癌。
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