重磅科研 | Science：核心生物钟基因Bmal1缺失后昼夜节律依然存在
昼夜节律是表现出约为24小时内源性振荡的诸多生物过程，其会受到一组核心时钟基因所驱动，众多的研究结果显示，核心时钟基因Bmal1缺失后全身的节律便会消失（如血压的节律等）。最近，令人惊讶的是来自美国宾夕法尼亚大学的研究团队报道在没有任何外源性驱动因素的情况下，Bmal1敲除（Bmal1-/-）小鼠的皮肤成纤维细胞（MSFs）和肝脏在2-3天内转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组仍然表现出明显的24小时节律性振荡。而这其中内在节律的表现势必是由于另外一个昼夜节律“起搏器”的存在，研究团队认为Bmal1-/-小鼠节律的产生可能是由ETS家族转录因子招募的转录性调控或者非依赖于转录的氧化还原反应所导致。
论文ID
原名：Circadian rhythms in the absence of the clock gene Bmal1
译名：生物钟基因Bmal1缺失后的昼夜节律
期刊：Science
发表时间：2020.2.14
影响因子：41.037
通讯作者：Akhilesh B. Reddy
通讯作者单位：宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）
DOI号：10.1126/science.aaw7365
背景介绍
生物节律按照周期的长短可分为超日节律、近日节律（昼夜节律）、亚日节律、近周节律、近月节律、近年节律等，而昼夜节律属于近日节律的范畴，昼夜节律是当前最普遍、最重要、研究最多的一种生物节律。而控制昼夜节律的内在时钟装置就是我们所熟知的“生物钟”。在哺乳动物中分为中枢生物钟和外周生物钟，中枢生物钟位于下丘脑的视交叉上核（即SCN），被视作昼夜节律的“起搏器”，SCN在调节自身组织节律外，它还会通过神经-体液等途径影响外周生物钟（如心脏、肝脏、肾脏等），中枢生物钟和外周生物钟彼此相互协调促进，有序地保证了生命活动和生理状态的规律性。随着该领域研究的不断深入，生物钟紊乱被视为众多心脑血管疾病、肾脏疾病及代谢疾病的危险因素之一，合理调整生物钟会对疾病的预防和预后会产生积极的影响。
生物钟受到一组核心时钟基因所驱动，包括Bmal1, Clock, Per1/2/3, Cry1/2，而这些核心时钟基因广泛存在于植物、动物，微生物，甚至是培养的细胞之中。Bmal1（又名Arntl, MOP3）是唯一一个单独全身敲除便可导致全身节律紊乱的基因，同时也有很多研究表明该基因缺失后会产生一系列消极负面的病理状态（如：寿命缩短、衰老、眼病、神经退行性病变、葡萄糖耐量受损等），故其重要性不言而喻。在哺乳动物中昼夜节律的主要“调节器”被认为是转录-翻译反馈回路（TTFLs），但在2007年Storch KF等人在Cell中通过实验证明视网膜内在生物钟的作用并提出Bmal1对于所有的分子振荡也许并不是必要的。随后陆续有许多课题组报道，特别是在全基因组或者蛋白质组层面上TTFLs并不一定能很好的诠释分子生物钟。基于此，研究者认为Bmal1缺失后如果节律依然存在，那么势必会有另外一个节律“起搏器”的存在，为此展开一系列研究工作。
结果
已有研究表明，Bmal1-/-小鼠在12h-light/12h-dark环境下，其活动度的节律明显存在，而在持续黑暗的环境下，该小鼠的活动度节律消失，而这种节律的消失很可能是由于外部光照环境的变化所导致的。在小鼠的肝脏测序结果FDR(False Discovery Rate)<0.05情况下有8002个基因是有明显的节律性表达，这些结果也运用RAIN(Rhythmicity Analysis Incorporating Nonparametric methods)算法进行了检测，但这种节律很有可能是在一个已经同步的环境下表现出来的。为避免外界环境因素的干扰，研究者将Bmal1-/-小鼠的肝脏离体进行切片培养（37℃恒温、无光照），在起始时刻用地塞米松（DEX，外周生物钟同步所用标准、普遍的一种激素）进行同步化处理，48h后开始每间隔3h收样，结果显示在Bmal1-/-小鼠的肝脏中4743个转录本有着明显的节律（图1.A, B），FDR<0.05时也仍然有2671个转录本节律性表达。有趣的是，Bmal1-/-小鼠肝脏绝大部分节律表达的转录本在Bmal1+/+小鼠中却没有节律，二者相互排斥，同时在相位分布上也有着略微不同（图1.C）。此外，研究者还把数据和另外一个研究团队体内肝脏的高通量结果进行比对（图1.D），结果发现有1271个基因在两组数据中是重叠的，两组数据来源的区别就在于一个是in vivo（无DEX处理，正常光照周期），另一个是ex vivo（DEX处理，无光照周期），为此想确定有哪些基因是可以受到DEX同步化，在WT和Bmal1-/-两组肝脏中上调2218个基因和2164个基因，同时显示在Bmal1-/-组肝脏中有623个基因是对DEX产生节律变化的反应（如图2所示）。同样地，研究者将Bmal1-/-小鼠的MSFs分离同样用DEX处理后间隔收样，得到了同肝脏切片体外培养相同的结论，即在没有外界环境的干扰下，Bmal1缺失的MSFs有大量的转录本依旧存在节律性表达（图1.E, F），这其中可能与另外的节律发生装置的参与联系紧密。
图1. (A)DEX同步离体肝脏组织切片的实验设计及样本收集时间间隔序列；(B)在不同限制条件下WT和Bmal1-/-两组肝脏节律基因的数量比较；(C)3个循环下两种基因型Bmal1+/+和Bmal1-/-肝脏组织切片有节律的转录本绘制的热图；(D)本文研究者的数据（DEX同步化处理的肝脏切片，无光照）和另外研究团队（12L/12D环境下饲养的小鼠体内肝脏）韦恩图做一比较；(E)在不同限制条件下WT和Bmal1-/-两组MSFs节律基因的数量比较；(F)3个循环下两种基因型Bmal1+/+和Bmal1-/- MSFs有节律的转录本绘制的热图。
图2. (A) DEX对WT和Bmal1-/-小鼠离体肝组织基因表达谱基因组水平的影响的实验示意图，分别在DEX同步后0、6、12和24小时取肝样本；(B) DEX处理分别上调WT 2218个和Bmal1-/- 2164个基因的表达(Padj < 0.05)，其中1297个(42%)基因在WT和Bmal1-/-基因中均有表达。
2 不同温度下Bmal1-/-小鼠的MSFs有节律的转录本和Bmal1+/+小鼠相比是互补的
研究者通过DEX处理同步成纤维细胞，并将其分别在27℃、32℃或37℃培养，使其完成两个完整的周期（图3），结果显示在Bmal1敲除的成纤维细胞中存在基因组层面的温度互补，即在不同温度下节律基因的数量是互补的（Bmal1+/+：27℃=113个，32℃=577个，37℃=1340个；Bmal1-/-：27℃=1397个，32℃=1169个，37℃=692个）。
图3.MSFs不同温度梯度实验策略的示意图。WT和Bmal1-/-的细胞用DEX同步后分别培养在27℃、32℃或37℃的不同温度环境，进行两个完整的昼夜节律周期，随后每2小时在恒定条件下(DD)的三个不同温度下收集样本，用于RNA-Seq分析。
由于生物钟是会受到外部环境影响的，因此，研究者用DEX同步两种基因型的成纤维细胞，间隔12小时（AM和PM）来模拟两个不同的时相，其他条件不变然后在相同的外部条件下每间隔3h收集样本（图4），一些转录本表达的相位在两组是完全相反的（图5），其中包含一些核心时钟基因，这充分说明它们保留了最初的相位，综上可得出结论在Bmal1缺失后所产生的的节律和温度的互补以及外界诱导因素息息相关。
图4. 昼夜节律转录组反相初始同步的实验设计示意图，WT和Bmal1-/-都做同样DEX间隔12h的同步化处理，然后在相同的外部条件下每间隔3h收集样本。
图5.(F)在WT细胞中，核心时钟基因的丰度 (FPKM)表达相位是相反的；(G)在Bmal1-/-的成纤维细胞中一些节律基因的相位也是相反的。
3 Bmal1缺失的组织中ETS转录因子节律性表达
Bmal1敲除后在肝脏切片和MSFs仍然有大量基因节律性表达，这是否和Bmal2的代偿作用有关？为此，研究者也做了详细的阐述，原因有三，（1）Bmal2受Bmal1调控，并且在Western Blot实验中没有检测到Bmal2的存在；（2）如果Bmal2能充分代偿Bmal1那么它至少能够驱动直接反应基因的节律性表达；（3）在Bmal1-/-和Bmal1+/+ MSFs以及肝脏组织中，下游的节律基因应该有大量的重叠，然而在高通量分析时并没有看到（图1.C,F）。但究竟是什么在这其中发挥着节律“起搏器”的作用呢？为此，研究者集中分析了dawn和dusk相位节律基因的启动子区，motif分析结果显示，ETS（E26 transformation specific）因子和Krüppel样因子（KLF）或者特异性蛋白（Sp）转录因子富集程度尤为突出（图6.A）。ETS转录因子在dawn相位富集程度最高，但是在dusk相位我们没有看到KLF或者Sp转录因子（图6.B）。Bmal1敲除小鼠在12L/12D环境下ETS转录因子呈现节律性表达（图6.C），并且ETS的结合位点在WT小鼠增强子RNA中较为丰富。许多ETS转录因子的敲低会导致U2OS细胞（节律研究中的一种工具细胞）周期长短发生明显的改变（图6.D）。由此可见，一些ETS蛋白在Bmal1缺失的细胞中可以促进转录水平的节律表达。另外一种机制可能是非转录依赖的，有研究报道在没有TTFLs时过氧化物还原酶（PRDX）蛋白的氧化-还原状态依然具有自主节律，此外，敲减PRDX会影响U2OS的节律。肝脏裂解后借助免疫印迹并使用PRDX/SO2/3监测PRDX的氧化还原状态，无论是Bmal1+/+的小鼠还是Bmal1-/-的小鼠PRDX/SO2/3的丰度都呈现周期约为24h的节律变化。
图6.(A)在小鼠中dawn和dusk相位节律转录调节因子的高频序列模体结构；(B)相位的频率分布显示多个ETS转录因子节律性表达；(C)恒定条件下(DD，左)Bmal1−/−小鼠的肝脏离体培养中三种ETS转录因子的节律性表达(q < 0.05)，以及光暗周期(LD，右)下Bmal1−/−小鼠的肝脏ETS转录因子的节律性表达(q < 0.05)；(D)在Bmal1−/−小鼠中， ETS转录因子的敲减引起U2OS细胞周期的改变；(E) Bmal1+/+小鼠和Bmal1−/−小鼠肝脏组织过氧化物还原酶的24h的变化情况。
4 Bmal1缺失后的蛋白质组和磷酸蛋白质组依然具有节律
与此同时，研究者想看一看这种非经典的节律是否也会影响蛋白质组和磷酸蛋白质组，昼夜节律在蛋白质组和磷酸蛋白质组方面都有一些报道，但是关于Bmal1缺失的所做的蛋白质组和磷酸蛋白质组却还不清楚，和前述实验设计一样间隔固定时间收集样本并进行质谱实验（图7.A）。结果显示两种小鼠的肝脏和MSFs中都有许多节律表达的蛋白质和磷酸化位点（图7.B,D）。研究者在WT小鼠的MSFs中检测到有585种蛋白存在节律性变化，在Bmal1-/-中检测到364种，并且这两种基因型蛋白质节律的相位重叠性很高（图7.C）。与WT相比，Bmal1-/-显著富集的生物过程包括代谢、细胞内运输和氧化还原，特定的细胞成分丰度较高，特别是线粒体及与其相关部分，Bmal1功能已有一些报道对线粒体分裂和融合动力学以及肝脏的功能具有重要意义。综上，Bmal1对于24h行为周期的正常维持是必要的，但是Bmal1对于转录、翻译以及翻译后的层面节律的正常维持并不是必需的，而在这其中ETS转录因子家族成员或者一些不依赖转录的氧化还原反应发挥了作用。
图7.(A)定量的蛋白质组学实验流程及实验设计图；(B) Bmal1+/+小鼠和Bmal1−/−小鼠MSF节律蛋白的热图分析；(C) Bmal1+/+小鼠和Bmal1−/−小鼠MSFs和肝脏节律蛋白相位的频率分布；(D)Bmal1+/+小鼠和Bmal1−/−小鼠MSF节律磷酸化位点的热图分析；(E)&(F) Bmal1−/−小鼠节律蛋白通过GO分析在生物过程和细胞组成两个部分富集到的排名前10位的通路（Bonferroni corrected p < 0.05）。