科研 | Cell Reports：使用单细胞转录组学定义皮肤稳态和伤口愈合过程中的表皮基底细胞状态
编译：Nicole，编辑：十九、江舜尧。
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上皮组织的维持是由干细胞驱动的，但是目前在单细胞水平的转录异质性了解非常有限。表皮基底细胞维持皮肤组织并促进伤口愈合，之前的研究发现干细胞和祖细胞中基底细胞的异质性，但是缺乏对分化过程中基底细胞动力学的全面剖析。本研究首次全面概述了哺乳动物皮肤细胞在准备愈合伤口时发生的主要变化，使用单细胞RNA测序、RNAScope和荧光寿命成像，在稳态皮肤中确定了3种非增殖性基底细胞状态和1种增殖性基底细胞状态，在代谢方面各不相同，并且在伤口上皮形成过程中过程中在空间上被分隔开。Pseudotemporal轨迹和RNA速度分析预测准线性分化系统，其中基底细胞从Col17a1Hi / Trp63Hi状态发展为早期反应状态，在这两个状态的交界处增殖，或在分化为棘细胞之前被阻止生长。伤口愈合诱导可塑性，表现为在多个基础转录状态下动态的基础-棘突互换。本研究提供了表皮细胞动力学的系统状态并丰富了表皮稳态的“层次-谱系”模型。
论文ID
原名: Defining Epidermal Basal Cell States during Skin Homeostasis and Wound Healing Using Single-Cell Transcriptomics
译名: 使用单细胞转录组学定义皮肤稳态和伤口愈合过程中的表皮基底细胞状态
期刊: Cell Reports（Cell子刊）
IF: 7.815（1区）
发表时间:2020.3.17
通讯作者: Qing Nie、Xing Dai
通讯作者单位: 美国加利福尼亚大学
DOI号: 10.1016/j.celrep.2020.02.091
实验设计
对正常或受伤小鼠皮肤中的细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以确定不同的基底细胞状态及其在伤口愈合过程中的基因表达差异。使用多重RNA原位检测（RNAScope）和荧光寿命成像显微镜（FLIM），将scRNA-seq揭示的分子和代谢异质性在皮肤组织中进行空间定位。伪时态轨迹和RNA速度分析不同的基底细胞状态的分化等级，用于揭示了伤口愈合过程。
结果
scRNA-Seq揭示了伤口愈合过程中皮肤细胞组成的整体变化
为了系统地检测稳态和修复之间的主要细胞类型和细胞状态差异，对从未受伤（UW）和受伤（WO）小鼠背部皮肤分离的样品进行了scRNA-seq（图1A）。伤口样本是在造成6毫米伤口后第4天收集的，授予主动上皮化的阶段（图1B）。经过质量控制后，获得了10,615个细胞（来自2个UW生物学重复）和16,164个细胞（来自3个WO生物学重复）。共确定了3种主要细胞类型：上皮细胞（Krt14或Krt1高表达）、成纤维细胞（Col1a2高表达）和免疫（Ptprc高表达）（图1C，1D）。与UW相比，WO中的免疫细胞和成纤维细胞的平均百分比有所增加，而上皮细胞的平均百分比有所降低（图1E）。
进一步分析UW和WO样品类型，利用已知的细胞类型标记鉴定（图1F，1G）。结果显示，UW中有15个细胞簇，WO中有14个细胞簇（图1F和1G）。关键细胞类型标记物的特征图揭示了表皮基底细胞（Krt14+）、棘突（Krt1+）、HF相关细胞（Krt17+）、免疫细胞（Ptprc+）和成纤维细胞（Col1a2+）的种群水平变化（图1H和1I）。同时发现几种新的细胞类型，包括巨噬细胞、树突状细胞、成肌纤维细胞和内皮细胞。分别使用F4/80和平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体证实了WO皮肤中巨噬细胞和成肌纤维细胞水平显著增加（图S3）。
图1. UW和WO皮肤中所有细胞的scRNA-Seq分析
（A）示意图。（B）对WO皮肤的H＆E分析。（C）所有五个样品的主要细胞类型群体的tSNE图，在括号中标出了占所有细胞总数中的相对百分比。（D）通过对细胞进行着色的tSNE图。（E）代表主要细胞类型种群的条形图。（F）2个UW重复的tSNE图。（G）3个WO重复的tSNE图。（H）在（F）中UW特定基因的表达的特征图。（I）在（F）中WO特定基因的表达。
毛囊间表皮细胞、毛囊（HF）和皮脂腺的上皮细胞驱动伤口再上皮化。这些细胞的亚簇分析显示，UW和WO样品中簇的数量相当，即4个基底细胞亚簇，2个棘突细胞亚簇和4个具有不同标记的HF亚簇（图2A，2B和2D–2G）。与之前研究结果相比，本研究结果不包含次要的loricrin +颗粒细胞，这可能是由于细胞收获过程的差异所致，但在UW和WO皮肤中均具有独特的增殖性基底细胞亚簇（图2A，2B，2D和2E）。总体而言，UW和WO皮肤之间各种上皮细胞类型的相对比例没有显著变化（图2C）。
图2. scRNA-Seq分析显示伤口愈合过程中上皮细胞组成的轻微变化
（A）来自UW皮肤的所有上皮细胞的tSNE图，括号中显示了每个簇中的细胞占所分析细胞总数（7,099）的百分比。（B）来自WO皮肤的所有上皮细胞（4021）的tSNE图。（C）代表UW和WO样品中主要上皮细胞类型群体的条形图。（D）UW上皮细胞中关键基因表达的特征图。（E）WO上皮细胞中关键基因表达的特征图。（F）来自UW皮肤的每个簇中富集的前10个基因的热图。（G）来自WO皮肤的每个簇中富集的前10个基因的热图。
伤口表皮基底细胞上调炎症和迁移相关的基因表达
进一步分离Krt14+/Krt17-CD34-上皮亚群来比较UW和WO表皮基底细胞（图2D和2E）。总共53和99个基因分别在UW和WO细胞中富集，但在单细胞中并不均匀，一些UW显示出WO样的特征（图3A）。在WO基底细胞中上调的基因包括炎性基因Cxcl2、Ccl2和Ccl7；上皮到间质转化（EMT）相关基因Snai2和Vim；以及阳性对照Krt16（图3B）。GO分析显示，WO基底细胞中的炎症相关基因富集（图3C）。WO基底细胞中的上调与伤口愈合、EMT或伤口新表皮前缘上调相关的基因（图3D）。此外，UW基底细胞包含两个不同的亚组，分别为TNF-a信号传导下调和缺氧高（图3D）。总之，这些数据表明表皮基底细胞在稳态过程中可能以不同的炎症状态存在，并且在伤口愈合过程中显着上调表达了炎症和迁移基因。
图3. UW和WO的表皮基底细胞之间的差异表达基因
（A）UW和WO样品的前10个差异基因的热图。（B）在UW和WO基底细胞中选择基因的表达。（C）使用GO（左）和Hallmark（右）基因组对UW和WO基底细胞的已鉴定标记物进行GO分析。（D）使用指定的分子标记进行基因评分分析。
UW皮肤中存在3种不同的非增殖（NP）基底细胞状态
进一步分析UW细胞异质性，观察到3个不同的亚簇（图4A和4B）：（1）具有Col17a1Hi标记的亚簇；（2）早期反应（ER）亚簇；（3）富含生长抑制（GA）的亚簇（图4C）。此外，富含GA和Col17a1Hi的基因在3个亚簇之间表现出反相关的趋势（图4C）。
基因表达方面，GA显示TNF-α信号、缺氧和EMT基因的表达最高（图4D）。相比之下，Col17a1Hi的炎症和EMT基因最低，但来自组织静止干细胞的“静止和干样”标志得分最高（图4D）。表皮分化基因表达从Col17a1Hi到ER和GA逐步增加（图4D）。这些数据表明，这3种基底细胞状态由炎症、迁移、静止和干性、细胞周期退出和分化状态方面的差异来定义。
使用RNAScope验证完整皮肤组织中三种NP基底细胞状态的存在，发现（1）Krt14转录本和K14蛋白的水平沿着表皮基底层波动，且并不总是重合；（2）Cdkn1a转录本存在于部分但并非全部K14阳性基底细胞中，并且在一部分基底上层细胞中检测到最高表达（图4E和4G）。Cdkn1a与Trp63和ER状态标记Id1的共同分析显示，基底层中存在唯一表达每个标记的细胞（图4F和4H-4J）。很少有细胞同时表达两个标记，Trp63和Cdkn1a表达是互斥的，没有表达所有三个标记的细胞（图4I和4J）。因此，表皮基底细胞在体内以多种NP转录状态存在。
图4.揭示UW表皮基底细胞内异质性的scRNA-Seq和RNAScope
（A）来自2个UW重复的NP基底细胞细胞的tSNE图。（B）（A）中每个亚簇的前10个标记的热图。（C）使用指定的分子特征标记进行基因评分分析。（D）RNAScope数据显示UW皮肤中Cdkn1a和Krt14转录本以及K14蛋白的空间分布。（E）UW皮肤中Cdkn1a、Trp63和Id1转录本和K14蛋白的空间分布。（F）量化代表性区域中每个单个细胞中Cdkn1a和Krt14转录本以及K14蛋白的荧光强度。（G）量化代表性区域中每个单个细胞中Cdkn1a、Trp63和Id1转录本和K14蛋白的荧光强度。（I）在单元格中Cdkn1a、Trp63和Id1表达的OncoPrint表示。（J）表达特定基因的细胞总数中专门表达Cdkn1a、Trp63或Id1的细胞百分比的条形图。
WO皮肤中存在3种不同的NP基底细胞状态，并且在空间上分区
为评估伤口愈合过程中基底细胞的异质性，对WO样本分析，发现3个不同的NP子群集，也将其称为Col17a1Hi、ER和GA亚簇（图5A-5C）。相应的UW和WO亚簇彼此共享最高水平的基因表达。WO的GA细胞富含与α5-整联蛋白阳性前缘、炎症和缺氧相关的基因（图5D）。
进一步分析WO皮肤中基底细胞状态的空间分布。对Col17a1和Trp63转录本的共同分析显示，从伤口周边到过度增生区，单阳性和双阳性细胞显着上调，但在迁移前沿减少（图5G和5H）。在伤口的过度增生区，GA标志物Cdkn1a主要在基底上层细胞中表达。但是，在迁移的前沿、基底细胞和基底上层细胞中都检测到了其强表达（图5I-5K）。沿WO区域整个基底层的Cdkn1a信号定量显示向迁移前沿明显增加（图5K）。相对于过度增生区或伤口远端的细胞，WO的GA标记Snai2（Slug）蛋白在移行前沿的基底细胞中富集（图5E）。ER标记Fos蛋白在增生区富集，但其表达在迁移区或UW区降低（图5F）。总体趋势是在增殖区和伤口周围富集Col17a1Hi和ER标记，在迁移前沿富集GA标记。
图5. WO皮肤中的基底细胞异质性
（A）来自2个WO重复的NP基底细胞的tSNE图。（B）每个亚簇的前10个标记的热图。
（C）显示关键标志物基因表达的小提琴图。（D）使用所示分子特征的基因评分分析。（E）Snai2蛋白的免疫荧光数据的定量分析。（F）Fos蛋白的免疫荧光数据的定量分析。（G）RNAScope数据显示WO皮肤中Col17a1和Trp63转录本以及K14蛋白的空间分布。（H）（G）中方框区域的放大图像。（I）RNAScope数据显示WO皮肤中Cdkn1a和Krt14转录本以及K14蛋白的空间分布。（J）（I）中方框区域的放大图像。（K）代表性WO皮肤切片中每个单个细胞中Cdkn1a和Krt14转录本以及K14蛋白的荧光强度定量。
正常和WO皮肤基底细胞的代谢异质性
分析不同基底细胞状态的代谢状态，结果显示在UW中，增生性基底细胞氧化磷酸化（OxPhos）和糖酵解最高，而GA显示最低的氧化磷酸化评分（图6A）。在WO中，Col17a1Hi的氧化磷酸化水平升高到与WO基底细胞相似的水平（图6B）。WO的GA状态的氧化磷酸化仍然得分最低，这与其缺氧反应因子Hif1α的mRNA表达最高保持一致（图6B）。糖酵解基因出现了明显相反的趋势， GA细胞在UW和WO皮肤中的糖酵解得分均高于其他亚组。
双光子激发（TPE）和NADH FLIM分析WO，在伤口外、增生部分伤口深处的区域和迁移前沿区域检测了NADH自发荧光（图6C和6D）并显示了TPE NADH的强度和寿命（图6E和6F）。游离的NADH比值代表了氧化磷酸化的相对水平。在伤口附近区域中观察到了葫芦形的分布（图6G），这表明UW皮肤中的基底细胞可以分为OxPhosHigh和OxPhosLow状态。在紧邻伤口并在伤口内的基底细胞中比率升高，在新表皮的相当一部分基底细胞中检测到了最高值（图6G和6H）。显示伤口新表皮中的基底细胞相对于UW出现OxPhosLow和糖酵解高状态。
图6. FLIM数据验证了WO皮肤中scRNA-Seq预测的代谢异质性
（A）使用氧化磷酸化标记对4个UW亚簇进行基因评分分析。（B）对4个WO基底亚群的基因评分分析。（C）伤口上皮的示意图，显示了用FLIM探测的区域。（D）由GFP表达指示的伤口表皮细胞的代表性图像。（E）NADH信号和NADH寿命信号的代表图像。
（F）具有相量指纹的代表性相量图，它表示快速傅里叶变换后感兴趣区域（ROI）中所有细胞的荧光寿命衰减。（G）所有细胞及其相应的自由/结合NADH比率的小提琴图。
伪时态轨迹和RNA速度分析揭示基底细胞状态转变动力学和伤口诱导的细胞可塑性
使用Monocle 2分析所有滤泡间隙表皮细胞，包括增殖和NP基底细胞如棘细胞。在UW和WO皮肤中，观察到了从Col17a1Hi状态延伸的三种路径：增殖的基底细胞、GA状态（通过ER状态过渡）和棘突细胞。
使用先前开发的方法scEpath基于批次效应校正数据（图7A-7D）。观察到了由基底细胞、增生基底细胞和棘细胞组成的3个截然不同且很大程度上分离的簇（图7A和7B）。在WO中，确定了相同的3个不同的表皮簇（图7C和7D）。
使用scEpath来推断和量化具有单细胞能量（scEnergy）的细胞谱系，发现源自Col17a1Hi基底细胞状态的近线性路径，表现为所有滤泡间隙表皮细胞的最低能量（图7E）。Col17a1Hi状态先转变为ER状态，再转变为GA状态，然后转变为棘细胞群（SP2至SP1），而增殖性基底细胞遵循一条从ER状态起源的旁路（图7E）。
为了进一步分析UW皮肤中的表皮分化动力学，利用RNA速度分析发现Col17a1Hi和SP1状态显示较小的RNA速度，而ER、GA和SP2状态表现出较大的RNA速度（图7F）。表明，表皮基底细胞在开始棘突分化之前通常会通过3个不同的状态转变，并且Col17a1Hi和ER状态之间的交界处的基底细胞的主动增殖助长了这种分化轨迹。
WO样品符合增生的UW基底细胞的循环动力学（图7G）。WO的Col17a1Hi基底细胞和SP1细胞中有相当一部分显示出比UW更快的RNA动力学。表明与UW相比，WO皮肤表皮细胞不仅更具活性，而且还表现出更强的可塑性和松弛的细胞分化限制。
进一步分析可能基底细胞状态转变的关键基因。scEpath分别从UW和WO数据集中识别了3,699和3,129个伪时间依赖性基因（包括Trp63、Fos和Cdkn1a）（图7H和7I）。有趣的是，与特定生化和细胞过程相关的基因定义了Col17a1Hi/ER向ER的转变（I和II组）、Col17a1Hi/ER向GA的过渡（III组），和GA状态（IV组）（图7H，7I）。转录因子（TF）占不到1％，差异很小。因此，转录后和细胞周期是基底细胞状态转变的伤口诱导重塑的基础。
总之，稳态皮肤中的Col17a1Hi基底细胞首先被激活，进入活跃的细胞周期并作为祖细胞增殖或经历生长停滞，随后分化成棘突细胞。尽管在伤口愈合过程中保持了这种多步的基底棘突分化轨迹，但是可塑性和分化流动性增加实现基底细胞和棘突细胞之间的双向转化。
图7。UW和WO皮肤的滤泡间隙表皮细胞的伪时态动力学分析
（A）UW表皮细胞的UMAP尺寸减小。（B）（A）所示基因的特征图。（C）所有WO表皮细胞的UMAP。（D）（C）所示基因的特征图。（E）scEpath预测的谱系分化图。（F）在（A）中将非线性RNA速度场投影到UMAP空间上。（G）在（C）中将非线性RNA速度场投影到UMAP空间上。（H）在UW和WO样品中，沿着Col17a1Hi至GA路径的3,699个UW伪时间依赖性基因的伪时态动力学。（I）沿着（H）中的伪时间，4个基因簇的平均表达模式（左）和富集的生物过程（右）。
讨论
迄今为止，已有报道使用scRNA-seq对小鼠和人皮肤的各种上皮成分进行了常规分类，对正常的再生和伤口愈合提供了重要见解，本研究进一步的深入。
发现Col17a1Hi基底细胞转录状态与干性及高氧化磷酸化作用有关，但具有低EMT、低分化、低缺氧和炎症、低能量和低RNA动力学。伤口再上皮化过程中Col17a1和Trp63表达的动态变化也表明Col17a1Hi基底细胞的动员。
ER基因被称为应激反应基因，之前有人提出在胚胎和成人伤口愈合过程中，这些基因的瞬时上调是启动修复过程的“启动”。本研究中原位检测到表达ER相关的Fos蛋白或Id1 mRNA的表皮基底细胞，表明即使在完整的UW组织中也可能存在ER基底细胞的转录状态。
与GA状态相关的EMT、糖酵解、低氧和炎症基因的高表达暗示其最容易对来自不断变化的组织微环境的细胞外信号作出反应，数据表明，在伤口愈合期间，GA基底细胞优先定位在最靠近缺氧伤口和浸润的免疫细胞的迁移前沿，进一步证明在愈合伤口中迁移和增殖在空间上是分开的，处于生长的新表皮尖端的迁移细胞通常缺乏增殖活性。同时伤口修复过程可利用正常表皮基底细胞的现有转录异质性，但会调节其增殖、迁移和代谢状态。
使用了4种计算工具来研究基底细胞的动态，显示了基底细胞在稳态皮肤中通过Col17a1Hi、ER和GA的顺序进展。研究结果突出了滤泡间隙表皮区室中多个转录状态的双向性。
同样令人感兴趣的是，鉴定出一个明显的增殖性基底细胞池，是一条独立的路径，与其余的基底细胞形成回路，从而为其余的基底细胞提供能量。这些细胞在Col17a1Hi和ER基底细胞状态之间的边界，表明（1）穿过该边界对于休眠的表皮基底细胞的活跃增殖可能至关重要；（2）Col17a1Hi和ER细胞负责产生更多的基底细胞，而GA细胞不再能够重新进入细胞周期来充当基底细胞自我更新的主要来源。
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