科研 | JXB：狗尾草花叶病毒可以诱导单子叶作物开花
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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病毒诱导开花(VIF)是利用RNA或DNA病毒表达花期基因来诱导植物开花。近年来这种植物病毒因为在开花生理研究和双子叶植物木本果树加快育种速度中的基础和应用受到广泛的关注。现在研究人员将这项技术推广到单子叶禾本和谷类作物。基于狗尾草花叶病毒（FoMV）的VIF系统，在糜子和小麦中FT基因的表达可以提早开花促进穗的发育。病毒表达的带FLAG或不带FLAG标签的开花位点（FT）基因的同源基因诱导两种单子叶植物的早花和穗/籽粒发育。在糜子中，水稻Hd3a的成花活性远高于其他双子叶FT基因。FoMViF系统操作简单，诱导开花和早穗早粒效率高。除了糜子和小麦之外，研究人员还设想将FoMViF应用于其他单子叶经济作物和生物燃料作物中。
论文ID
原名：Foxtail Mosaic Virus-induced Flowering Assays in Monocot Crops
译名：狗尾草花叶病毒诱导单子叶作物开花的研究
期刊：Journal of Experimental Botany
IF：5.36
发表时间：2020.2
通讯作者：洪益国，施农农
通讯作者单位：杭州师范大学生命科学与环境科学研究院
DOI号：10.1093/jxb/eraa080
实验设计
本研究选取糜子CGRIS 00000390，冬小麦YZ4110作为实验材料，在长日照（LD）或短日照（SD）条件下23℃培养。在本氏烟草中富集FoMV用于植株的接种，收集幼叶组织，直接用于FoMViF分析。针对4个FT基因分别构建不带FLAG标签和3XFLAG标签的FoMViF载体，将4种带有FT基因的病毒接种糜子和小麦，进行FoMViF分析及不同基因的诱导活性差异分析，并通过RT-PCR和WB分别检测FT基因在mRNA水平和蛋白水平表达。
结果
1 单子叶植物中FOMV诱导的开花（FoMViF）
FoMV载体可以传递发夹双链RNA（dsRNA）来沉默单子叶植物中的基因。在该载体中，FoMV外壳蛋白（CP）亚基因组启动子在原CP启动子上游复制。研究人员设想在，在PVX载体中设计重复启动子也可以从重组病毒基因组中合成额外的亚基因组RNA作为mRNA，以促进蛋白质的有效翻译，从而使得花期基因通过FoMV在单子叶植物中进行病毒表达（图1）。图1A中概述了FoMViF分析的步骤。（1）将FT基因（或任何花期基因）克隆到双元载体FoMV上（图1B）中，并通过测序验证。（2）将重组的FoMV载体转入根癌农杆菌GV3101或LBA4404中。（3）将带有双元载体FoMV的农杆菌直接注射到茎中，接种单子叶植物进行FoMViF。本研究将没有FLAG标签和3xFLAG标签的拟南芥AtFT、水稻Hd3a、番茄SFT和烟草NtFT4克隆到FoMV载体中，得到载体结构图（图1B）。研究人员探究了糜子和冬小麦早花的诱导和非诱导条件，并在非诱导条件下检测这些FT基因是否能被FoMV表达，以及病毒表达的FT基因能否在非诱导条件下触发糜子和小麦早花。
2 糜子和小麦的开花条件
为了研究FoMViF在单子叶植物中的应用，研究人员选择了两种作物，研究比较少的糜子和主要的粮食作物小麦。为了测试糜子在实验室中对光周期的反应，研究人员在SD（8h光照/16h黑暗）和LD（16h光照/8h黑暗）和SD，LD混合的方式来种植材料（图2）。在SD条件下，植株播种后平均56天后（DASS）开始形成小穗（图2A），此时在LD下，小穗未发育，发育延迟3-5周（图2B），平均在88DASS左右出穗（图2C，表1）。先在LD下生长4周然后转为SD的条件下在63DASS开花形成小穗（图2D）。因此说明糜子是一种兼性短日照植物。
对于六倍体小麦来说低温春化处理是开花和小穗形成的关键。先在4℃下对小麦进行4周春化后在23℃的低温条件下生长（16h光照/8h黑暗）条件下，在90 DASS诱导开花/小穗形成（图2E）。相同条件下，对照组，FoMV空载和4个FoMViF的小麦同时开花，因此，该条件不能用于FoMViF分析。在没有春化的情况下，小麦在23℃的低温条件下保持生长并在126天或更晚观察到开花/形成小穗。因此研究人员选择诱导性较小的LD或未经春化处理的LD来研究FoMViF是否能在这些单子叶植物中引发早花和小穗发育。
3 FoMViF诱导糜子早花
在三叶期（21DASS）用病毒侵染的本氏烟草接种糜子幼叶，全部被感染（图3）。与对照组（图3A）相比，接种FoMV、FoMV/AtFT、FoMV/Hd3a、FoMV/SFT和FoMV/NtFT4的植株在接种后约1周发生局部感染（28 DASS），接种叶片上出现不规则马赛克和黄化病变（图3B-F）。在新叶上也出现了相似的症状，通过RT-PCR很容易检测到FoMV-FT mRNA（图3G），重组FoMViF病毒缺失了插入的FT基因，并逆转为FoMV。与对照组相比，接种组长势较矮（图3H-M）。在63DASS时，用FoMV/Hd3a表达水稻Hd3a成花素基因的糜子发育出小穗（图3K），随后75-76DASS，FoMV/AtFT（图3J）和FoMV/SFT（图3L）也陆续抽穗。此时在对照和接种FoMV的植株中未观察到开花或小穗的发育（图3H，I），对照组抽穗的时期比外源表达FT基因的植株晚（图3M）。这些结果表明，在单子叶植物糜子中成功地建立了FoMViF。
4 糜子中单子叶和双子叶FT基因在开花诱导中的活性差异
在FoMViF分析中，单子叶和双子叶FT基因具有不同的诱导开花的能力（图3，表1），AtFT和SFT对开花诱导和有一定影响，而NtFT4对开花和小穗形成时期影响很小（表1）。FoMV/Hd3a的水稻Hd3a基因的表达诱导了花和小穗的发育，明显早于其他三个双子叶的FT基因和对照。病毒FT转录本（图3G）在不同FoMViF载体处理的糜子中表达水平相同，但开花时间不同，说明在四个被测的单子叶和双子叶FT基因中，单子叶水稻Hd3a基因糜子中诱导开花效率最高。
5 FLAG标签FT蛋白表达对糜子开花时期的影响
为了进一步研究在LD下，糜子中FT基因的表达与诱导早花的相关性，用3xFLAG标签标记了Hd3a、AtFT、SFT和NtFT4（图1B，图4）。在接种FoMV/AtFT、FoMV/Hd3a、FoMV/SFT和FoMV/NtFT4的植株中通过RT-PCR检测FoMV-FT标记mRNA（图4A），用特异性抗体检测标记的FT蛋白（图4B和C）。FT转录本和蛋白产物的表达与这些植株的病毒感染有明显的关系，在接种FoMV的植株中检测到FoMV-RNA，但是在对照组中没有检测到病毒表达的FT-RNA或FT蛋白（图4A-C）。与未接种和接种FoMV比，单子叶（Hd3a-FLAG）和双子叶FT蛋白（AtFT-FLAG、SFT-FLAG和NtFT4-FLAG）的表达能够诱导早花（图5A-F）。FLAG标签对水稻Hd3a蛋白成花活性的负作用，但对双子叶FT蛋白功能的影响并不明显（表1，表2）。四种FT-FLAG融合蛋白在LD下没有显著性差异，能使原植株提前4-11天开花（图5，表2）。
6 小麦中的FoMViF
为了验证FoMViF法在其它单子叶植物上的可行性，分别在2-3叶期（约21DASS）的小麦幼苗上接种（图1A，图6），在23℃下低温生长，没有进行春化。叶片在接种后1周（28DASS，图6A和B）发生局部褪绿和黄化，随后整株发病。接种后8周，对照组未见开花抽穗及籽粒发育，而在接种FoMV/Hd3a的小麦植株上出现第一个穗（图6C和D）。在119 DASS时，对照植株继续保持营养状态并没有生殖生长过渡，而病毒表达Hd3a的小麦植株在此阶段发育出第2、3和4穗（图6F和G）。甚至在用FoMV/Hd3a表达Hd3a的植株籽粒完全成熟后，对照植株也没有明显的抽穗开花现象，对照组，接种FoMV组和接种FoMV/Hd3a-FLAG在很晚时期才开始抽穗（图6G）。尽管Hd3a mRNA水平相对较低，但在接种FoMV/Hd3a的表达与开花诱导和小穗发育密切相关（图6H），FLAG标签的Hd3a融合蛋白在接种FoMV/Hd3a的植株中很容易检测到，但在接种FoMV和对照组中没有检测到。
讨论
植物病毒由RNA或DNA基因组组成。这些病毒基因组可以作为RNA载体和基因表达载体在植物功能基因组学中进行修饰。例如，对传统正向或反向遗传操作难以适应的作物通过利用VIGS技术已经成为一种在转录、转录后或翻译水平上抑制基因表达的有效工具，用于解剖双子叶植物和单子叶植物的基因功能。
目前，由于缺乏合适的病毒，还没有开发禾本科作物的VIF。研究人员首次发现FoMV可用于表达FT基因，并诱导禾本科作物糜子和谷类作物小麦的早花和小穗发育。
重组病毒不稳定，通常在侵染过程中会发生重组。重组FoMViF病毒缺失了插入的FT基因，并逆转为FoMV。而成花FT蛋白一旦在植物发育早期表达，就会启动营养生长向生殖生长的转化，进而导致开花。说明植物生长后期不需要持续产生FT-mRNA和蛋白质。因此，重组病毒本身的稳定性可能不会对VIF技术带来影响。因为研究发现，在糜子和小麦中，即使FoMViF载体转化回FoMV，这些具有病毒表达的FT蛋白的植株仍然出现早花现象。
由于FoMV是一种ssRNA病毒，它有一种dsRNA中间产物，是植物VIGS的活性触发因子。因此，许多ssRNA病毒通常用于VIGS，而较少用于基因传递和蛋白质表达。然而，这并不是FoMViF的问题。首先，FT蛋白和磷脂酰乙醇胺结合蛋白结构域在不同的植物物种中保守，糜子PmFT与水稻或双子叶植物之间没有足够的同源性导致沉默。 其次，FoMViF检测是在非开花诱导条件下进行的。这意味着很少或没有内源性的FT-mRNA产生，因此VIGS发生的靶mRNA很少或没有。第三，病毒表达的成花FT的表达可能发生在侵染的早期和/或后期，因此，无论VIGS是否被诱导，都会触发植物开花。
FoMViF技术有以下优点，包括（1）单体基因组使FoMV更容易处理，接种的病毒在单子叶植物中具有高度的传染性。（2）在单子叶和双子叶植物中寄主广泛，使得FoMViF和其他基于FoMV的技术适用于许多其他重要的作物。（3）FoMV可有效表达蛋白用于单子叶植物的功能分析。（4）单子叶和双子叶FT基因之间的活性差异以及标签对FT功能的影响为基于FoMViF的谷类作物育种方案提供了开花基因的选择，这取决于对花和小穗/谷粒诱导的不同要求。
光周期FT介导的花诱导途径在不同植物间是保守的，FoMViF对C3小麦有效，继而提出了该技术可应用于C3和C4作物的想法。
评论
研究人员首次利用基于FoMV的VIF系统，在糜子和小麦中表达FT同源基因可以促进开花和小穗的发育。在两种单子叶植物中的成花是由病毒表达的FT基因引起的，在糜子中，水稻Hd3a的成花活性比双子叶植物的FT基因高。该系统操作简单，诱导开花效果好。除了糜子和小麦之外，推测FoMViF在功能基因组学和谷类改良分子育种方面也将适用于许多其他重要的食品应用和生物燃料相关的单子叶植物。
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