科研| J CLIN INVEST：抑制SLC7A11/谷胱甘肽轴会形成KRAS突变型肺腺癌的合成致死（国人佳作）
编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。
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致癌性KRAS是肺腺癌(LUAD)的主要驱动因素，但尚未被治愈。在本文作者发现SLC7A11/谷胱甘肽显示与致癌KRAS代谢合成致死有关。通过代谢组学方法，发现激活突变的KRAS能显著增加细胞内胱氨酸水平和谷胱甘肽生物合成。SLC7A11是一种胱氨酸/谷氨酸逆转运蛋白，具有胱氨酸摄取的特异性，在KRAS突变LUAD患者中过表达，并与肿瘤发展呈正相关。此外，通过基因沉默或柳氮磺吡啶药物抑制SLC7A11后，可以在体外有选择性地杀伤KRAS突变癌细胞并在体内抑制肿瘤生长，表明SLC7A11的功能和特异性可作为治疗靶点。并且我们进一步确定了一个有效的SLC7A11抑制剂，即HG106，能显著降低胱氨酸摄取和细胞内谷胱甘肽生物合成。此外，HG106表现出对KRAS突变细胞的选择性细胞毒性作用，是通过增加氧化应激和内质网应激介导的。值得注意的是，在几个临床前肺癌小鼠模型中，用HG106治疗KRAS突变型LUAD造成明显的肿瘤抑制和延长生存期。总之，我们的研究结果表明SLC7A11可以抑制KRAS突变型LUAD细胞，这为目前无法治愈的疾病提供了有价值的治疗方法。
论文ID
原名：Suppression of the SLC7A11/glutathione axis causes synthetic lethality in KRAS-mutant lung adenocarcinoma
译名：抑制SLC7A11/谷胱甘肽轴会形成KRAS突变型肺腺癌的合成致死
期刊：The journal of clinical investigation
IF：12.282
发表时间：2020.4.1
通讯作者：逄秀凤
通讯作者单位：华东师范大学
实验设计
实验结果
1. KRAS突变促使谷胱甘肽代谢的重编程
为了探索KRAS突变驱动的癌细胞代谢的弱点，我们获得了人胰腺上皮netin表达(HPNE)细胞，无论这类细胞是否表达突变型KRAS(G12V)。采用气相色谱联合TOF质谱(GC/TOF-MS)进行代谢组学分析。聚类分析和热图分析显示，HPNE和HPNE/KRAS被分到不同的代谢物群，这意味着它们的代谢特征存在显著差异(图1A)。这些明显发生改变的代谢物的通路富集分析进一步证实了在KRAS突变细胞中改变了许多代谢途径，其中受影响最为显著的是谷胱甘肽代谢途径(图1B)。虽然在我们的实验中精氨酸和脯氨酸代谢途径与谷胱甘肽代谢途径相比更为富集丰富，但对于KRAS突变型肺癌中精氨酸和脯氨酸代谢的作用，我们从现有的文献还不能推断出任何机制上的解释。由于谷胱甘肽代谢在KRAS驱动的肿瘤生长中展示出新的作用，我们将重点放在这一代谢途径的机制研究和抑制剂鉴定上。如图1C所示，HPNE/KRAS细胞中谷胱甘肽代谢的关键中间体显著上调，包括胱氨酸、谷氨酸和谷胱甘肽。胱氨酸是谷胱甘肽生物合成过程中的主要限速因子，从细胞外环境通过胱氨酸/谷氨酸抗转运系统输入。因此，根据细胞生长和生存对KRAS突变状态的依赖性，我们选择两个配对同基因的细胞系进行量化它们的胱氨酸水平。正如预期，与野生型相比，KRAS突变的HPNE (HPNE/KRAS)细胞和KRAS突变的H522(H522/KRAS)细胞表现出更高水平的Na+非依赖性[14C]-胱氨酸摄取，并伴有显著的谷胱甘肽生物合成(图1D)。作为谷胱甘肽上调的结果，KRAS突变细胞产生更多ROS以维持氧化还原平衡(图1D)。这与先前的研究一致：大量ROS的产生是RAS激活的特征之一。这些数据表明KRAS突变细胞通过从细胞外环境吸收更多的胱氨酸来维持高活性谷胱甘肽的生物合成。
2. SLC7A11在KRAS突变的LUAD中过表达
考虑到KRAS突变细胞吸收更多的胱氨酸，我们着手确定SLC7A11是否是这一生物过程的主导因素。通过使用成对的KRAS同基因肺和胰腺细胞系，我们发现了突变KRAS能上调SLC7A11 mRNA水平(图2A)。NF-E2相关因子2 (Nrf2，也被称为NFE2L2)是SLC7A11的一个特殊转录因子，Nrf2的转录水平在HPNE/KRAS and H522/KRAS细胞中被上调(图2A)。此外，引入KRAS突变后SLC7A11和Nrf2的蛋白水平升高(图2B)。为了进一步支持这些发现，我们检测了SLC7A11蛋白在小鼠肺肿瘤中的表达。Western blot分析显示，LSL-KrasG12D转基因小鼠气管内给予腺病毒cre诱导4个月后，肺肿瘤组织中SLC7A11表达较邻近正常组织增加(图2C)。在分离的小鼠胚胎成纤维细胞中也观察到类似的结果(图2D)。这些数据表明SLC7A11表达与KRAS突变状态呈正相关。为了研究致癌基因KRAS调控Nrf2的机制，我们在KRAS突变A549和H441细胞中沉默KRAS基因，发现Nrf2和SLC7A11蛋白水平下降(图2E)，提示Nrf2可能是KRAS的靶点。为了了解Nrf2介导SCL7A11上调的机制，我们通过CRISPR/Cas9构建了Nrf2-KO A549和H441细胞株。我们的结果表明，Nrf2基因敲除后抑制了SLC7A11表达(图2F)，表明Nrf2介导KRAS突变下SLC7A11的表达。为了识别负责Nrf2和SLC7A11表达的KRAS效应因子，我们进一步使用几种药理学抑制剂来特异性阻断A549和H441细胞中KRAS的主要下游通路，包括MAPK通路、PI3K/AKT通路和Ral通路(图2G-H)。我们的研究结果表明，抑制KRAS下游的关键因子可以降低SLC7A11和Nrf2在mRNA和蛋白水平的表达。这些结果表明KRAS下游的关键通路具有调节Nrf2/SLC7A11轴的能力，这意味着存在一种协同调节机制。
同时，我们研究了SLC7A11在携带KRAS突变的LUAD患者中的临床意义。我们收集来自中国宁夏医科大学宁夏总医院的原发性LUAD样本(n = 51)。根据KRAS突变状态进一步对肿瘤样本进行分类，直接进行DNA测序分析。IHC分析显示，SLC7A11在LUAD中的表达高于邻近正常肺组织(图2I)。生物信息学分析表明SLC7A11在几种人类癌症类型中均过表达(补充图2A)。重要的是，将LUAD样品分为KRAS突变和WT组时，我们发现，与KRAS WT样本相比，KRAS突变型LUAD的SLC7A11水平要高得多(图2J)。此外，T分期显示SLC7A11蛋白水平的升高与肿瘤的发展密切相关(图2K)。值得注意的是，TCGA数据库中LUAD中SLC7A11基因表达的升高与KRAS和NRF2基因表达水平相关。这些结果共同表明SLC7A11在KRAS突变型LUAD中过表达，并可能参与LUAD患者的肿瘤发展。
由于Keap1/Nrf2通路在LUAD和肺鳞癌中经常发生改变，我们接下来检测了Keap1在配对KRAS同基因的胰腺和肺细胞系中的表达(HPNE和HPNE/KRAS；H522和H522/KRAS)。与Nrf2表达升高相比(图2A-B)，Keap1表达水平在这些细胞中几乎没有变化。为了进一步确认SLC7A11和Nrf2或Keap1之间的相关性，我们进行IHC染色来评估人类LUAD中Nrf2和Keap1的表达水平。我们的结果表明与KRAS WT LUAD或邻近正常肺组织比较，Nrf2在KRAS突变型LUAD中过表达。此外，Nrf2高表达与KRAS突变型LUAD中SLC7A11高表达相关。然而，相比之下，这些组间Keap1的IHC信号无差异，与SLC7A11表达无相关性，说明Nrf2和SLC7A11的激活可能非依赖于Keap1调控机制。
3. 沉默SLC7A11可以选择性地杀死KRAS突变的LUAD细胞
为了探索SLC7A11在细胞生长中的功能作用，我们将KRAS同基因细胞系中的SLC7A11基因沉默(图3A)。利用C911寡核苷酸检测siRNAs靶向SLC7A11的特异性。我们的结果表明，沉默SLC7A11可以抑制细胞生长(图3A)，并对KRAS突变细胞具有高选择性地促进ROS产生，而对WT细胞几乎没有影响(图3B)。基于这些观察，我们进一步检测了另外32个癌细胞系中SLC7A11基因沉默。我们的结果表明沉默SLC7A11导致KRAS突变细胞和WT细胞之间的细胞毒性有显著差异(图3C)。为了验证SLC7A11是突变KRAS相关的弱点，我们在KRAS实验系统中检测了SLC7A11抑制剂柳氮磺吡啶的作用。柳氮磺吡啶是FDA批准的一种药物，通常用于治疗慢性炎症性疾病，并已被证明可减少胱氨酸。在我们配对的KRAS同基因细胞系中，我们发现KRAS突变细胞更容易被柳氮磺吡啶治疗，并且IC50值更低(图3D)。柳氮磺吡啶选择性地杀死KRAS突变型癌细胞系，与KRAS WT型癌细胞系相比，IC50值更低(图3E)。在克隆形成实验(图3F)和软琼脂克隆形成试验(图3G)中，硫柳氮也显著降低了A549细胞的生长。这些结果表明SLC7A11有选择性地和有效地抑制KRAS突变型LUAD细胞。
4. 柳氮磺吡啶导致体内肿瘤消退
根据上述体外研究结果，我们进一步在LSL-KrasG12D小鼠体内模型中测试柳氮磺吡啶的治疗作用。表达Cre重组酶的腺病毒诱导癌基因表达12周后，再用生理盐水、曲美替尼、柳氮磺吡啶随机处理小鼠4周(图4A)。与空白组相比，日剂量为250 mg/kg的柳氮磺吡啶可显著抑制肿瘤(图4B-C)，并显著提高总体生存率(图4D)。柳氮磺吡啶在1 mg/kg/d剂量下的疗效与MEK抑制剂曲美替尼的疗效相当。综上所述，这些结果表明SLC7A11对于KRAS突变LUAD的体内生长至关重要，靶向SLC7A11是治疗该疾病的一种潜在的治疗策略。
5. 鉴定HG106是一种有效的SLC7A11抑制剂
柳氮磺吡啶对KRAS突变型肺癌细胞有选择性抑制作用，而对WT肺癌细胞无作用(图3和图4)。然而，目前所有可用的SLC7A11抑制剂，包括柳氮磺吡啶，对SLC7A11的靶点特异性都很低。我们的体内数据也支持这一观点，即只有在高剂量，即每天高达250 mg/kg的情况下，柳氮磺吡啶才会产生令人满意的治疗效果(图4B-C)。高剂量的柳氮磺吡啶用于治疗人类癌症时可能会造成不良反应和脱靶效应。因此，我们试图通过化合物筛选及同时通过放射性和荧光分别监测细胞内胱氨酸摄取和谷胱甘肽生物合成，来寻找更有效的SLC7A11抑制剂。
基于化合物对A549细胞中谷胱甘肽产生的抑制作用，在一个商业购买的文库中进行了初步筛选。筛选的实验群体的均值和SD值以Z得分表示。因为大部分化合物的Z得分指标范围为2到-2，我们认为“击中”的那些化合物的Z得分应低于-3。基于这一标准，我们确定了8种有效降低谷胱甘肽产量的化合物，其中化合物575148排在首位。有趣的是，这些有效化合物大多是具有苯并三唑骨架的一系列化合物。因此，基于化合物575148的结构性质，进一步合成并修饰产生了几个衍生物。这些衍生物随后在细胞谷胱甘肽水平和胱氨酸摄取的筛检中进行评估。其中小分子HG106表现出最强的功效(图5A)，因此被选为候选物，在KRAS突变型LUAD中进一步评估。HG106抑制KRAS突变型LUAD细胞中[14C]胱氨酸消耗(图5B)和谷胱甘肽产生(图5C)，呈浓度依赖性，以1.25 μmol/L为最低有效浓度。10 μmol/L浓度HG106的疗效相当于1 mmol/L浓度柳氮磺吡啶的疗效，说明HG106有100倍更强的活性。
为了确认和验证HG106的靶点特异性，我们接下来进行了代谢组学分析，以表征HG106治疗介导的代谢变化。我们的结果显示，HG106改变了多种代谢途径，如预期的那样，谷胱甘肽生物合成排在第一位(图5D)。谷胱甘肽代谢途径中的关键代谢物，如胱氨酸、谷胱甘肽和甘氨酸的水平被抑制(图5E)。HG106对KRAS突变H441细胞产生显著的细胞毒性作用，活性的明显降低是由于β-巯基乙醇和半胱氨酸的增加，据报道它们可以通过直接增加半胱氨酸转运来激活谷胱甘肽的合成。此外，SLC7A11基因沉默显著降低了HG106的功效，表明其对SLC7A11的特异性(图5G)。在KRAS中含G12S突变的A549细胞中也观察到了类似结果。HG106可激活ERK，但对一组激酶、RAS活性或其他MAPK通路成分无明显抑制作用。
6. HG106优先降低KRAS突变LUAD细胞的生存能力
SLC7A11促进胱氨酸摄取和谷胱甘肽生物合成，保护机体免受氧化应激。因此，我们假设HG106抑制SLC7A11会导致KRAS突变细胞中ROS水平升高。我们采用流式细胞术测量ROS水平。如图6A所示，HG106剂量依赖性地增加了A549细胞中总ROS水平。ROS清除剂N -乙酰半胱氨酸(NAC)治疗后显著降低了HG106的细胞毒性(图6B)，说明ROS介导HG106的细胞毒性作用。在我们的研究中，10 mM的NAC对A549和H441细胞的体外生存能力有微小的影响，这与其在小鼠体内的促瘤作用不一致，提示抗氧化剂对肿瘤细胞增殖的影响可能依赖于一个长期的治疗过程。
ROS引起的氧化应激可诱导线粒体内膜电位(MMP)的快速去极化，并导致氧化磷酸化损伤，这是三羧酸循环的功能输出。我们接着检查HG106是否抑制线粒体氧化磷酸化。如图6C-D所示，HG106剂量依赖性地降低了A549和H441细胞的耗氧量，破坏了MMP。利用透射电子显微镜，我们还观察到用HG106处理细胞后表现出线粒体肿胀，类似于过氧化氢的作用(图6E)。ROS的积累同时介导内质网应激(ER)。我们的研究结果进一步表明，HG106增加了 ER应激相关标志因子(IRE1α, PERK和GRP78)的激活(图6F)以及CHOP、ATF4、ATF6的转录(补充图10)。这些数据表明，在HG106存在的情况下，线粒体功能障碍和ER应激显著增加，这是细胞内ROS水平升高的结果。
致癌性RAS驱使ROS产生，而RAS突变细胞则表现出对ROS操纵因子的敏感性。我们接下来检测了HG106对KRAS突变细胞系的选择性细胞毒性。正如所料，与野生型相比，HG106对KRAS突变细胞系的存活率影响更大(图6G)。HG106还选择性地杀死了上述KRAS突变癌细胞系(图6H)。重要的是，与KRAS突变细胞相比，正常细胞受HG106的影响较小，说明了HG106的安全性和低毒性。有趣的是，HG106治疗并没有导致自噬相关细胞死亡或铁死亡。ROS介导的线粒体功能障碍和ER应激升高与促进肿瘤细胞凋亡有关。据此，HG106在KRAS突变LUAD细胞中显著诱导细胞凋亡(图6I)和抑制克隆形成(图6J)。所有这些结果表明，HG106导致KRAS突变型LUAD细胞中ROS水平的显著升高，进而造成选择性地细胞ER应激与细胞凋亡。
7. KRAS突变型LUAD对HG106的体内反应
基于HG106的体外药效，我们在一系列临床前小鼠模型中研究了其对KRAS突变LUAD的体内抗肿瘤活性。我们首先建立了肺癌细胞异种移植小鼠模型。A549细胞被注射到4-5周的雄性裸鼠的背部皮下。当肿瘤达到150 mm3体积时，小鼠每日腹腔注射生理盐水或不同剂量的HG106。如图7A所示，在试验剂量下，HG106的持续治疗导致延长了肿瘤生长抑制时间。为了在更高的翻译水平上研究HG106的疗效，我们建立了一个病人来源的LUAD异种移植(PDX)模型，该模型含有KRAS中的G12V突变。治疗3周后，HG106明显抑制PDX肿瘤生长(图7B)。值得注意的是，HG106治疗效果的耐受良好，因为在这些研究中，没有任何一组动物表现出系统性毒性。HG106在剂量为2或4 mg/kg时显著增加患者来源的异种移植瘤中ROS的产生和TUNEL信号(补充图14A-B)，验证了HG106在体内触发ER应激而诱导细胞凋亡。
为了进一步探索HG106对小鼠生存的临床意义，我们单独激活致癌性KRAS或结合TRP53功能缺失来对两种条件的遗传模型进行了疗效实验。在LSLKrasG12D小鼠中，HG106显著降低了肺肿瘤体积。受感染的LSL-KrasG12D对照小鼠的生存期为39天，而两个HG106治疗组的生存期分别延长至81天或106天。KRAS致癌等位基因的激活足以启动肺的肿瘤发生过程，而肿瘤抑制基因的缺失或定点突变可导致腺癌的明显快速发展，它们具有与人类相似的更为晚期的疾病特征。因此，我们建立了LSL-KrasG12D/+、Trp53fl/fl小鼠模型，发现在1个月的时间里，对照组LUAD生长迅速，并快速扩散到整个肺组织。然而，与对照组相比，HG106治疗组能造成明显的肿瘤抑制(P < 0.001；图7C-D)。更令人鼓舞的是，HG106疗法产生了更高的长期生存优势(P = 0.0048；图7E)。基于4个临床前小鼠模型的结果，我们证实了HG106在体内表现出较强的疗效，为LUAD的治疗提供了一个满意的治疗措施。
之前的报道已经表明KRAS突变型肿瘤细胞与WT细胞相比具有明显的代谢需求。最近，在3D克隆系统中进行的一项合成致死筛选中，发现了干扰嘧啶生物合成的二氢乳酸菌脱氢酶抑制剂能选择性抑制KRAS突变型胰腺癌的生长。线粒体谷氨酸转运体SLC25A22也被鉴定为KRAS的合成致死伙伴。这些研究表明靶向代谢合成致死可能是一种有前景的癌症治疗方法。在我们的研究中，我们揭示了KRAS突变型细胞对谷胱甘肽的依赖。我们发现，在KRAS突变激活的情况下，内源性谷胱甘肽水平升高，胱氨酸摄取增加(图1)。谷胱甘肽在维持氧化还原稳态中具有重要的抗氧化作用。由于氧化还原平衡失衡，KRAS突变型细胞倾向于增强谷胱甘肽介导的解毒作用。
众所周知，SLC7A11具有独特的功能：胱氨酸摄取的特异性反向转运体。研究表明SLC7A11在几种类型的癌症中上调，并代表一个独立的预后因子。此外，SLC7A11通过供应胱氨酸而维持谷胱甘肽进而产生耐药性。Nrf2是内源性抗氧化合成的主要转录调节因子，下调KRAS或抑制PI3K能抑制Nrf2活性并进一步调控ATF4。在我们的研究中，我们在实验中加入了Ral GTPase抑制剂RBC8，发现它也可以抑制Nrf2，尽管其效果低于MEK抑制剂，提示KRAS效应通路在调控Nrf2转录和功能方面可能存在协同作用。在氧化应激中，Nrf2能激活下游的SLC7A11等因子。然而，SLC7A11与KRAS突变体之间的直接联系尚未明确。我们的结果显示突变KRAS显著促进了谷胱甘肽的生物合成(图1)。在这两个KRAS同基因细胞系和人类KRAS突变型LUAD组织中，SLC7A11丰度与KRAS突变激活呈正相关，与Nrf2表达同步(图2)。与之前已发表的研究一起证明了KRAS引导Nrf2表达增加是Nrf2抗氧化通路激活的机制。ATF被报道为Nrf2的转录靶点和异源二聚体。KRAS突变型癌症依赖于谷胱甘肽生物合成的增加，可以通过SLC7A11沉默来进行治疗(图3)。几种抑制SLC7A11转运活性的药物已被鉴定，其中最有希望的是FDA批准的磺胺嘧啶，通常用于治疗慢性炎症。与SLC7A11基因缺失的结果一致，KRAS突变型细胞对磺胺嘧啶也更敏感。在LSL-KrasG12D小鼠模型中，磺胺嘧啶显著降低肿瘤负荷(图4)，这与之前关于其在其他类型肿瘤中的体内抗肿瘤活性的研究一致。总的来说，这些结果证实了SLC7A11是KRAS的合成致死伙伴，我们的研究提供了这两个因素之间的直接联系。
考虑到现有SLC7A11抑制剂的效力，联合治疗可能是实现抑制SLC7A11临床效益的最佳途径。多项证据表明，联合抑制SLC7A11和其他靶点具有协同效应。HDAC抑制剂抑制SLC7A11可导致BRAF抑制剂耐药细胞的细胞死亡。此外，有报道称，SLC7A11抑制剂可以通过消耗谷胱甘肽，诱导TP53突变型癌细胞大量凋亡，从而与突变的p53发挥协同作用。鉴于这些，将HG106与其他临床药物(如MEK抑制剂或化疗药物)联合使用可能有希望从根本上治愈KRAS突变型LUAD。
讨论
大约30%的LUAD肿瘤携带KRAS突变，但目前还没有临床应用的靶向策略。为了应对这一挑战，作者分析了带有或不带有KRAS突变的同基因细胞的代谢失调，以确定治疗KRAS驱动LUAD的代谢缺陷。我们发现KRAS突变激活后代谢物发生了显著变化，尤其是谷胱甘肽生物合成的中间产物。进一步确定了SLC7A11通过赋予胱氨酸摄取的特异性而调控谷胱甘肽代谢，SLC7A11为KRAS突变型LUAD的合成性致死靶点 (图8A)。我们发现SLC7A11在KRAS突变LUAD细胞和组织中高度过表达，展现出与肿瘤发展的显著相关性。靶向SLC7A11在体内外均显著抑制KRAS突变LUAD的生长和存活，表明SLC7A11是一个功能性的可翻译的靶点。更重要的是，通过一个功能性的药物筛选，发现了一种强有力的SLC7A11抑制剂——HG106。HG106抑制SLC7A11可以有选择性地增加了代谢应激和氧化应激介导的KRAS突变LUAD的细胞凋亡(图8B)。总之，我们的研究结果表明，SLC7A11/谷胱甘肽轴的抑制会导致KRAS突变型LUAD的代谢性致死。KRAS突变状态和SLC7A11功能需求之间的合成性致死可能为KRAS突变型癌症的治疗提供有望的治疗方法。
原文链接：https://doi.org/10.1172/JCI124049