科研 | Gastroenterology：原发性硬化性胆管炎中必需营养素的肠道微生物代谢改变
编译：微科盟北越城主，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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实验设计
实验结果
在对170亿对配对序列进行测序和质量控制后，我们可从387个个体中进行5.5 TB的数据分析，这里总共136例PSC，158 HCs和93例IBD对照患者（表1)。
表1 研究队列中原发性硬化性胆管炎和健康对照特征的总结
注：补充表4提供了IBD对照的人口统计学信息。HC均未使用任何所述药物。 连续数据以中位数（最小到最大值）给出，计数数据以n（％）表示。
AB，抗生素；ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；BMI，体重指数；G，德国人；GGT，γ-谷氨酰转移酶；N，挪威人；不适用，不可用；PPI，质子泵抑制剂。德国队列中缺少10种HC的aBMI数据，除非另有说明，否则其他数据完整。
1.微生物分类和遗传多样性
在合并队列中，总体微生物组组成在表型(PSC、HCs和IBD)之间有显著的变化（图1A），这在单独分析每个队列时也很明显（图1B和C）。地理位置也是影响所有表型（包括HC）（图2A）的总体微生物组组成的重要因素。
与HCs相比，PSC患者的微生物基因丰富度（观察到的基因）显着降低（图1D），而且在调整年龄，性别和体重指数时，伴随的IBD对PSC患者的基因丰富度没有影响。
图1 PSC患者和对照组的总体细菌分类组成和基因丰富度
(A)PSC患者、健康和IBD对照组的微生物组的不同。(B)德国人群队列的肠道微生物变化。(C)挪威人群队列的肠道微生物变化。(D)与对照组相比，PSC中观察到的基因数量。(A-C)中的所有组质心代表排序中各组各自点的算术平均值。
2.个体差异
经过质量控制和过滤后，整个数据集中共鉴定出413个类群（种群到菌株水平）。对于每个国家，我们分析了样本中零分类率小于80％的单个分类单元，也分析了分布的变化（mu）和零丰度的差异（nu）。该分析确定了与HC相比，PSC中的Clostridiumasparagiforme和未分类的埃希氏菌属物种丰度显著增加，以及几种物种显着减少，包括：Ruminococcusobeum，Eubacteriumsiraeum和Receuticaleutale；此外，有9个物种显示显著增加并且我们发现与HCs相比，PSC患者中5个物种显示显著降低（图2B）。尽管几种细菌在IBD中表现出相似的模式，但IBD和HCs之间的物种如Ruminococcusobeum, Bacteroides intestinalis和几种梭菌都没有差异。
先前的研究发现PSC中Veillonella属的含量增加。与HCs相比，PSC患者体内的Veillonellaatypica，Veillonellaparvula，未分类的Veillonella呈上升趋势。与PSC相关的其他物种包括除变形杆菌（Proteusmirabilis）和鸡肠球菌（Enterococcusgallinarum）之外的肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae），这些细菌以前与PSC的肠屏障功能和免疫反应有关。由于挪威队列中的丰度低，我们最初的分析未包括肺炎克雷伯氏菌。一项有针对性的分析表明在25％的PSC患者的微生物组中能够检测到肺炎克雷伯菌，但在HC中仅为4.4％，而在IBD对照组微生物组中有45.2％检测到肺炎克雷伯菌，仅在少数患者中检出了鸡胆小球菌和奇异疟原虫。当对一部分德国样品进行物种特异性实时聚合酶链反应时，肺炎克雷伯氏菌在PSC，IBD和HCs中的流行率相似，而在少数样品中检测到了鸡胆小球菌和奇异疟原虫。
为了进一步描述表型之间的结构微生物组差异，我们使用SparCC生成了细菌物种丰度互相关网络，HC中的网络由几个大的和小的簇组成（图2C）。当覆盖在PSC中观察到的协相关时，PSC患者的HCs中的网络被破坏，损失了几个簇，而其他簇则较少（图2D）。与HC相比，没有PSC的IBD对照品也显示出网络破裂，但与PSC中观察到的明显不同。
图2 PSC与HCs物种组成的差异
（A）在PSC和HCs中丰富度不同的物种和（B）差异不同的物种。物种通过门属关系着色。（C）HCs和（D）PSC患者的细菌丰度相关网络。在（A）和（B）中，森林图中的三角形/条表示对数（奇数比）/SE。（C）和（D）中的红线和蓝线分别表示物种之间的正相关和负相关。结节的大小反映了每种表型的平方根变换后的中位数相对丰度，而包围的结节标记了关节点。仅显示r>0.4的相关性，而相关系数的增加则通过增加线宽来反映。
3.在原发性硬化性胆管炎中微生物组的遗传环境中的广泛变化，突出显示氨基酸和B维生素的生物合成变化
总体而言，过滤后我们检测到两个队列中均存在121个代谢途径和424个酶家族。除106个酶家族外，我们还发现与HCs相比，PSC患者的微生物群中53种代谢途径差异性丰富。
与HCs相比，PSC患者的微生物组显示，与支链氨基酸（BCAA）异亮氨酸生物合成相关的代谢途径显着减少（图3），以及与BCAA异亮氨酸，缬氨酸和亮氨酸相关的几种酶家族水平也显著降低（图4A-C），IBD患者的水平与PSC中的水平相似。与芳族氨基酸生物合成相关的代谢途径也存在差异，但不一致，某些途径富含PSC（L-苯丙氨酸生物合成的PWY6628超级途径），而其他途径则被耗尽，例如，芳香氨基酸生物合成的COMPLETEARO-PWY超级途径，如图3所示。与HC相比，PSC中7种最富集的代谢途径中有4种与其他2种氨基酸，即精氨酸和鸟氨酸的生物合成有关（图3）。这4种途径在PSC和IBD中的水平相似，但直接比较中，与HC相比，这些途径中只有2种在IBD中显着富集。
与HC相比，PSC患者显示出与硫胺素（维生素B1）的生物合成有关的代谢途径水平更高（例如，硫胺素二磷酸生物合成的THISYN-PWY超途径I，图3）。该途径在PSC和IBD中显示出相似的水平，而IBD患者显示出比HCs高的水平；然而，生物合成硫胺素（维生素B1）的关键中间体5′-磷酸核糖基-5-氨基咪唑（PWY6122，PWY6277和PWY6121）的3种代谢途径在PSC中都被消耗掉了（图3）。此外，与几个与维生素B6代谢相关的酶家族的HC相比，PSC患者表现出显着差异，最突出的是EC4.3.3.6吡哆醛-5磷酸合酶的显着消耗（图4D），这是一种单独构成吡哆醛5'-磷酸生物合成II和从头合成活性形式维生素B6，吡哆醛5'-磷酸（PLP）和EC2.6.1.52磷酸丝氨酸代谢途径的酶。后者是构成代谢途径PYRIDOXSYN-PWY：吡哆醛50-磷酸生物合成I的7个酶家族中的1个，与HCs相比，PSC中的酶家族增加（图3）。至于该代谢途径中的最后6个酶家族，与HC相比，PSC中富集了1个（EC1.1.1.290），其中3个表现出相似的水平（EC2.6.99.2、1.1.1.262和2.2.1.7），并且，后2个（EC1.2.1.72和1.4.3.5）未通过我们的初始过滤，共有84个物种参与了数据集中的EC4.3.3.6吡哆醛-5-磷酸合酶。在荟萃分析中，与HCs相比，在PSC中E.taleal和Eubacterium.siraeum的丰度显著降低（见图2A），同时这两个物种也是促成该酶丰度最高的5个物种之一。有28个物种构成了PYRIDOXSYNPWY：吡哆醛5'-磷酸的生物合成I，但在元分析中检测到的所有贡献物种均未显示PSC和HCs之间存在差异。
关于其他B族维生素，还减少了两种酶，分别是EC2.7.1.26核黄素激酶和EC2.7.7.2黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶，这些酶负责合成维生素B2的活性形式。在PSC中（图4E和F），核黄素合酶（EC2.5.1.9）负责导致核黄素和5-氨基-6-D-核糖基氨基尿嘧啶合成的反应，在PSC中富集（图4G）；此外，PSC患者的微生物组显示出与氨产生有关的酶家族丰富（图4H和I）。与HCs相比，PSC还丰富了与抗生素抗性相关的酶家族（如EC3.5.2.6内酰胺酶）（图4J）。
图3 PSC微生物组中代谢途径的改变
热图和森林图显示了来自各个队列（热图中的左2列）和荟萃分析（热图和森林中的右列）的PSC和HC之间的微生物组代谢途径。森林图中的三角形/条表示对数（比值）/SE。
图4 PSC患者肠道微生物组的遗传潜力
点状图显示了与BCAA微生物代谢相关的酶家族（EC等级为4级）的相对丰富度（A）缬氨酸，（B）亮氨酸和（C）异亮氨酸，（D）维生素B6（PLP）的活性形式（E）维生素B2，黄素单核苷酸（FMN）和（F）黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的活性形式，以及（G）核黄素（维生素B2）和相关代谢产物的合成，（H，I）氨的产生，以及（J）抗生素耐药性。红色条形表示中位数。
4.原发性硬化性胆管炎患者微生物组中的代谢途径减弱，血浆中相关代谢物水平降低
由于最初的微生物组分析确定了BCAA和B维生素在细菌代谢中的潜在变化，而肠道微生物组可能是这些代谢产物的重要来源，我们从血浆中选择了维生素B和BCAA代谢物进行了研究，其中有191名PSC患者的队列研究（在宏基因组研究队列中也招募了27名患者）和48例HCs，与HCs相比，PSC患者血浆中维生素B6，PLP和BCAAs异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸的主要活性形式明显减少（图5A–D）；与对照组相比，PSC中的其他维生素B6代谢产物（即吡哆醛和4-吡啶氧酸）含量也较低。此外，维生素B2（核黄素）代谢物黄素单核苷酸的PSC水平降低，相当于EC2.7.1.26的降低，而维生素B2本身没有差异。对于维生素B1，与对照组相比，PSC患者的硫胺素相似，而PSC中的硫胺素单磷酸盐减少。在有微生物组和代谢组学数据可用的27名患者中，这些B维生素的血浆水平与相关代谢途径或酶家族的相对丰度不相关，这可能是由于粪便和血浆采样之间的间隔长；与HCs相比，PSC患者的必需氨基酸组氨酸减少了；在其他测定的氨基酸中，只有鸟氨酸在PSC中有所增加。
因为BCAAs的循环水平与肠道微生物群将这些氨基酸运输到细菌中的潜在能力有关，我们专门研究了5个与BCAA向细菌内向运输有关的基因和基因组。在荟萃分析中，这些基因组的PSC丰度显着高于HC，IBD的水平与PSC相似。
微生物代谢物可能会改变疾病的严重程度，因此，我们调查了代谢产物与PSC无肝移植生存之间的关系。达到临床终点的患者的血浆PLP和BCAA（即异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸）的浓度均低于未达到临床终点的患者。当将血浆浓度分成四分位数时，这些代谢物的低水平都强烈预示着无肝移植的存活率降低（图5E–H）。对于PLP而言，效果似乎特别强（图5A和E），这与Cox回归模型中的肝移植或死亡风险降低相关，而与Mayo风险评分和肝纤维化评分无关。PLP还与肝移植或死亡风险降低相关，而与其他风险评分无关。PLP可能被碱性磷酸酶代谢，两者呈中度负相关，但添加到模型后，碱性磷酸酶与存活率并不是独立相关。校正Mayo风险评分后，异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸与肝移植的无生存期无关。
图5 微生物群系相关血浆代谢产物与肝移植术后生存期
(A)与hc相比，PSC患者血浆中活性维生素B6代谢物PLP，(B)异亮氨酸，(C)亮氨酸和(D)缬氨酸，(E)PLP、(F)异亮氨酸、(G)亮氨酸和(H)缬氨酸的低水平均与PSC中肝移植存活的减少有关。
5.微生物组作为原发性硬化性胆管炎疾病表型和临床特征的生物标记物
当在物种数据上应用随机森林模型时，我们能够以较高的预测能力从HC中鉴别出PSC，并且从IBD鉴别出PSC（图6B），同时将PSC与HCs和IBD分开具有类似的预测能力。添加人体测量学信息（即年龄，性别和体重指数）对PSC与HCs的预测影响很小，并且通常使用物种数据表现优于酶家族和代谢途径来分离表型。
最后，我们合并了两个微生物组队列，以分析PSC患者临床个体之间的差异。比较有和没有IBD的PSC患者，我们无法检测到基因丰富度，种类，代谢途径或酶家族的任何差异。在患有和不患有IBD的PSC患者之间，总体细菌组成均没有显着变化。PSC中的微生物基因丰富度与疾病持续时间或Mayo风险评分之间没有相关性。在一部分可以进行肝硬度测量（通过瞬时弹性成像法测量）的德国PSC患者中，肝硬度与基因丰富度没有显着相关性。在测试肝硬度与酶家族以及与维生素B6或BCAA合成相关的代谢途径之间的关联时，肝硬度增加与EC6.1.1.4亮氨酸转移RNA连接酶水平降低之间存在弱关联，但不适用于任何其他已测试的功能。
在PSC患者中使用熊去氧胆酸（UDCA）与Erectale水平升高有关，PSC中的HC含量较荟萃中的HCs减少（图2A）。UDCA的使用还与Veillonelladispar的丰度降低有关；此外，UDCA使用者和非使用者之间的β多样性（Bray-Curtis）发生了细微的变化。我们没有发现美沙拉敏对任何物种有任何显着影响，美沙拉敏和UDCA的使用均与酶家族或代谢途径的差异无关。值得注意的是，UDCA仅在挪威PSC患者队列中进行分析，因为94%的德国PSC患者在取样时使用了UDCA。
图6 应用随机森林分类技术分离临床表型
(A)PSC vs HC和(B) PSC vs IBD。使用所有可用物种(红线)或仅使用重要物种(蓝线)的结果。
讨论
在本研究中，我们分析了挪威和德国受试者的2个队列中的粪便微生物组，其中包括PSC，IBD和HCs患者。在第三组独立的挪威PSC和HC患者中，我们使用高分辨率鸟枪宏基因组测序和靶向代谢组学研究方法，发现了一个与PSC相关的微生物组，它具有低基因计数和多样性，不受并发IBD的影响，现在可以在物种水平上鉴定；PSC微生物组中与例如维生素B6合成和BCAA合成有关的基因功能的显着改变; PSC中维生素B6和BCAAs的血浆浓度降低，以及这些代谢物的低浓度与无肝移植生存率的降低密切相关，表明研究微生物代谢改变可能有助于查明与PSC病程有关的生物学变化。
通过使用鸟枪宏基因组测序，我们在研究PSC的微生物组研究中取得了重大的飞跃，提供了编码酶和代谢途径的微生物基因的详细功能分析。与HCs相比，PSC患者与几种必需营养素如BCAAs和维生素B6（例如PLP）的细菌合成相关的基因显示出明显的变化。PLP是维生素B6的活性形式，是许多代谢反应的重要辅助因子，有助于肠道免疫调节和淋巴细胞向肠道的运输。PLP可以通过2个独立途径从头产生，大多数能够生产PLP的生物体使用的主要途径是通过单一酶（EC4.3.3.6），该酶在PSC中显着耗竭。PSC中不那么丰富的多酶途径PYRIDOXSYN-PWY：吡哆醛5’磷酸的生物合成增加。总的来说，宏基因组学数据表明PSC患者中合成PLP的遗传潜力降低，需要进一步在实验模型系统中进行评估。据估计，肠道细菌合成维生素B6的能力满足每日推荐摄入量的86％，暗示肠道微生物组的改变可能会极大地影响饮食需求。在血浆中进行的靶标代谢物分析表明，PLP和其他B6种类（吡哆醛和4-吡啶氧酸）的浓度均降低，这表明PSC中存在真正的维生素B6缺乏症。值得注意的是，已知PLP在不同程度的终末期肝病中会降低，不仅与自身缺乏有关，而且还归因于PLP对吡哆醛的分解代谢增加，例如在慢性炎症的情况下通过碱性磷酸酶或其他机制引起的。尽管如此，独立于Mayo风险评分的预测效果仍可能指出了PLP在终末期肝病之外的PSC中的作用。综上所述，细菌功能改变的鉴定为我们指出了重要的生物学，该生物学也被系统地改变了。应该强调的是，我们的研究结果没有显示出肠道和血液之间的直接联系，但是其他研究应该调查这种联系，以及PLP是代表PSC中疾病活动性和严重性的机制还是仅是疾病活动性和严重性的标志物。
关于微生物合成和饮食需求的类似考虑与BCAAs有关。已知肝硬化患者中循环BCAA会减少，但包括PSC在内的晚期肝脏疾病也会减少。与此相反，胰岛素抵抗患者的循环BCAA水平升高，与微生物组的合成能力提高相关，同时将这些BCAA转移到细菌中代谢的能力降低。在PSC中，我们发现了相反的情况，即细菌合成的减少和对细菌的进口能力的提高，这需要考虑肠道微生物组是否有助于在PSC中观察到血浆BCAA浓度降低。在我们的研究中，血浆BCAA的低浓度预示着肝移植的存活率降低，但与Mayo风险评分无关，这表明BCAA的改变可能与疾病阶段有关。关于这些代谢物在人中PSC中的作用的确切结论需要进行干预试验，例如补充治疗，而维生素B6或BCAAs作为PSC中预测性生物标志物的潜在临床价值则需要进行独立的验证研究。值得注意的是，由于在几种病因的肝病中均观察到维生素B6和BCAA的缺乏，因此在其他肝病中也可能会观察到相似的肠道微生物组相关调节因子作用。
对于其他测定的代谢物，肠道微生物组与血浆水平之间的关系不太明显。对于硫胺素和核黄素，这可能是由于肠道微生物的潜在贡献较低，据估计仅能满足每日推荐摄入量的2％-3％。然而，在PSC中与核黄素代谢相关的细菌基因的改变可能是有趣的，因为这些改变是细菌核黄素代谢产物的来源，细菌核黄素代谢产物是激活在粘膜相关恒定T细胞必需的，而这些T细胞是与PSC相关的在肝脏中丰富的先天性T细胞。
肠道微生物组的功能方面很重要，但特定细菌物种的作用也很重要。我们观察到经典潜在病原体埃希氏菌的增加，以及通常被归类为短链脂肪酸丁酸酯生产者的物种的减少。先前的工作强调了PSC中Veillonella属的相对丰度增加在Nakamoto等人的一项研究中，从PSC患者中分离出的12 K肺炎病毒株对小鼠肝胆损伤的敏感性增加，并且细菌易位。根据Nakamoto等人的研究，在本研究的宏基因组学测序数据中，肺炎克雷伯氏菌在PSC患者中的发生率比HCs高。使用更敏感的方法（定量聚合酶链反应）在德国队列的一小部分中，与鸟弹枪测序数据相比，PSC患者中发现的肺炎克雷伯菌序列比例更高，但在PSC和HCs中的流行率相似。肺炎克雷伯氏菌等非常低的丰富类群的临床相关性值得怀疑，而且肺炎克雷伯菌在人PSC中的作用尚不明确。正如Nakamoto等人的文章的实验数据所暗示的，只有肺炎克雷伯氏菌种的特定菌株才有可能诱导肝胆损伤，这突出了在进一步的微生物组研究中提高分辨率的必要性。有趣的是，最近关于酒精性肝炎患者的研究中也提出了类似的概念，他们粪便中粪肠球菌的丰度也很高。粪肠球菌E菌株具有产生外毒素胞溶素的能力与更严重的疾病相关。总体而言，似乎单个微生物和微生物的集体代谢能力都发生了变化。肠道微生物组可能会改变人类疾病，而不一定是触发事件，这样的机制可能指向新的治疗机会。
一个重要的观察结果是，无论是否在微生物物种和功能水平上，患有或不患有IBD的PSC患者的微生物组之间都具有惊人的相似性。与之前的数据一致，没有肝病的IBD中的总体微生物组组成与PSC患者不同；然而，PSC患者和没有PSC的IBD患者之间几乎没有任何物种和功能差异，这表明PSC与IBD的区别与多个物种或功能的变化有关。这是可能的研究挑战，找到适当匹配的有和没有PSC的IBD患者用于对照病例研究是非常困难的。
地理位置的差异带来了另一个挑战，但也可能是病例对照研究中的重要因素。此外，在挪威和德国队列中，采样和DNA提取的方式有所不同。在某些研究中，地理位置确实是微生物组组成的最强预测因子，突显了在多队列国际研究中确定和验证核心特征以定义真实疾病特征的必要性。但是，在目前的研究中，不可能研究确定挪威和德国之间地理或处理方法上的差异。
这项研究的主要优势是使用了两个来自不同国家的独立病例对照队列，并使用了最新测序方法。尽管据我们所知，这项研究是迄今为止使用全基因组测序对PSC患者中的微生物组进行研究的最大队列，但通过纳入更多患者以及肝病对照，结果的可靠性可能会进一步提高。值得注意的是，到目前为止，我们发现微生物组变化与代谢物差异和预后之间的联系是显著关联的。如果要进一步探索这些联系，时间和受试者匹配的血液和粪便样本在进一步的研究中也很重要。肝移植终点在不同的国家可能有所不同，可能使其作为临床考虑因素较小。另一个限制是饮食数据只能通过标准问卷进行粗略的调查，因此饮食因素可能会影响我们的研究结果。此外，由于采用横断设计，我们无法辨别检测到的变化是否在疾病发作之前或之后，这限制了得出因果关系结论的可能性。由于PSC是一种罕见的疾病，因此很难描述发病期间的微生物群信息。但是，应该建立起更大的国际随访资料库，以帮助解决这些限制因素。
结论
总之，与HCs相比，PSC患者的肠道微生物组表现出较大的功能差异，包括必需营养素的微生物代谢，而这些差异与IBD无关。与肝移植生存相关的相关循环代谢产物的改变表明，总体微生物功能可能与PSC的疾病进程有关。