科研| ENVIRON SCI-NANO: 暴露在土壤中的工程纳米材料改变了土壤根际代谢物的分布和玉米的代谢途径（国人佳作）
编译：Peragh，编辑：谢衣、江舜尧。
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准确评估纳米工程材料（ENMs）在环境中的风险对纳米技术的可持续发展和应用具有重要意义。土壤代谢组学反映了植物群落和微生物群落对ENM暴露的综合响应。此外由于微生物和植物释放的代谢物有助于土壤有机碳(SOC)的形成和积累，所以受影响的植物和微生物活动引起的土壤代谢物组成变化可能会改变SOC库的富集。在本试验中，玉米植株生长在添加SiO2、TiO2或Fe3O4(100 mg kg-1土壤)的土壤中4周。植物和土壤代谢组学随后被用来研究植物和土壤对ENM暴露的代谢响应。所有供试的ENM都没有对植物生长产生负面影响。然而代谢组学分析表明，所有ENM处理都以ENM依赖的方式改变了叶片、根系和土壤代谢物的分布。与用纳米材料SiO2处理相比，Fe3O4和TiO2能够诱导叶片、根和土壤发生更强的代谢重编程。有趣的是，没有直接暴露在ENMs中的叶片组织的氨基酸代谢库发生了显著的改变。在土壤中的内醚糖、亚麻酸、4-羟基肉桂酸和异肌醇含量显著增加。土壤代谢物组成的变化表明，ENMs改变了土壤有机碳库，同时结合叶、根和土壤代谢组学，可以对植物新陈代谢和土壤化学进行彻底的表征，这可以成为ENM风险评估的有力工具。
论文ID
原名：Metabolomics reveals that engineered nanomaterial exposure in soil alters both soil rhizosphere metabolite profiles and maize metabolic pathways
译名：代谢组学揭示了暴露在土壤中的工程纳米材料改变了土壤根际代谢物的分布和玉米的代谢途径
期刊：Environmental Science:Nano
IF：7.587
发表时间：2019.6
通讯作者：赵丽娟&季荣
通讯作者单位：南京大学环境学院
实验设计
本实验所用土壤采自中国科学院海伦农业试验站，采集土壤上部的20cm，在纳米水中制备了1000mgL−1的SiO2、TiO2和Fe3O4原液。应用于土壤之前，将悬浮液在冷水中以45 kHz的频率浸泡30min，直到获得稳定的分散体。所有ENMs的最终剂量均为100mgkg-1土壤。塑料容器(9 cm×9 cm×7 cm)装满100g生长基质(40g农用土和60g盆栽土)。盆栽土壤(0.68%N，0.27%P2O5，0.36%K2O，pH 4.28)是为了确保栽培期间有足够的养分供应，特别是为了避免有可能扭曲的植物的营养供给压力。本实验总共设有四个处理：对照组（无ENMs）、100mgkg-1 SiO2、100 mg kg-1 TiO2和100 mg kg-1 Fe3O4，每种处理种植4株植物（每盆2株）。这些植物在温室中栽培28天，白天25°C，晚上20°C。日光强度为180μmol m-2s-1。在生长期，根据需要浇水，不额外施肥。
实验结果
1叶绿素含量与生物量
暴露于ENMs没有导致明显的毒性或应激迹象(图1A)。同样光合色素(叶绿素a、b和类胡萝卜素)的含量在纳米材料SiO2和TiO2处理下没有变化。然而，纳米材料Fe3O4使叶绿素b含量显著(p<0.05)增加(22.7%)(图1B)。这与以前的研究结论超顺磁性氧化铁提高了大豆的叶绿素含量是一致的。此外与对照相比，纳米材料Fe3O4处理显著(p<0.01)增加了叶片15%的生物量。根和茎的生物量没有受到明显影响，然而添加纳米材料Fe3O4显著提高了总新鲜生物量(p<0.05)(图1C)。类似地也有相关报道指出纳米材料Fe3O4促进了花生生物量和叶绿素含量，但是Fe3O4促进叶绿素b的作用机制尚不清楚。相比之下，SiO2和TiO2纳米颗粒对玉米生物量没有显著影响，这与以往的报道不同。有报道指出50 mg kg-1TiO2显著增加莴苣地上部干重和长度。有些学者也观察到TiO2纳米颗粒(高达100mgkg−1)对小麦幼苗根长和生物量的正向影响。据推测，观察到的ENMs的植物毒性取决于植物种类、颗粒大小和表面电荷。我们测定膜脂质过氧化指标丙二醛(MDA)含量是评价ENM暴露对细胞膜完整性的影响。结果表明，在玉米植株的根或叶组织中，没有任何一种ENMs能够增加MDA水平，表明没有诱导脂质过氧化。相反TiO2处理显著降低了玉米叶片中MDA的含量(p<0.05)。这可能表明TiO2在缓解植物氧化胁迫方面具有保护作用。有些学者还观察到，当存在400mgkg−1的ZnO纳米颗粒时，芫荽中的丙二醛水平也降低了。
2硅、钛、铁及营养元素在植物和土壤中的分布
已知的纳米材料SiO2在植物根际相对稳定，而TiO2和Fe3O4更容易溶解，将Ti(Ti4+)和Fe(Fe3+和Fe2+)释放到土壤和根际中，我们发现玉米组织(叶和根)中的Si，Fe和Ti含量及其在土壤中的水溶性含量(生物有效性)与对照组(表1)相比没有变化，表明Si/SiO2，Ti/TiO2和Fe/FeO2没有被吸收和转移。这些结果还表明，纳米材料Fe3O4培养4周后，土壤pH从5.35降至5.13(p<0.05)，但Fe3O4对Fe离子的释放几乎可以忽略不计，这一结果与前人的研究是一致的。
有趣的是，与对照组相比纳米材料SiO2、TiO2和Fe3O4的暴露显著(p<0.05)降低了土壤47-64%的水溶性铜含量。ENMs可能作为铜离子的吸附剂或螯合剂，降低了土壤中该元素的溶解量。另一种解释是，这些ENMs引发了一些代谢产物以根系分泌物的形式释放到土壤中，与Cu离子发生螯合作用，降低了Cu的生物有效性。例如，已经发现有机酸和烟胺能够与金属离子结合。在根组织中，ENM暴露对矿质营养水平没有影响。而Fe3O4处理的叶片中Mg和Mn含量分别比对照提高了18%和5%，差异较为显著(p<0.05)。镁是叶绿素分子的中心原子，许多关键的叶绿体酶受到镁离子的强烈影响。锰作为植物中许多酶反应的激活剂，激活了几个重要的代谢反应，在光合作用中起着重要的作用。此外叶片中镁和锰的增加可能直接导致了叶片中叶绿素含量和叶片生物量的增加。然而纳米材料Fe3O4提高叶片中Mg和Mn含量的潜在机制仍在研究中。
表1玉米组织和土壤水溶性组分中元素含量（mgkg-1）
3 ENMs对叶片代谢组的影响
采用气相色谱-质谱联用技术，对玉米叶片中287种代谢产物进行了鉴定和半定量分析。PLS-DA分析结果如图(图2A)所示，与对照相比，基于暴露于不同ENM的叶片代谢物的组成在第一主成分中有明显的分离，这解释了数据中14.7%的变异。这些结果清楚地表明，ENMs暴露诱导了玉米叶片代谢产物谱的改变，这在某种程度上是意想不到的，因为ENMs没有直接暴露于这种组织，也没有观察到表型变化。有研究表明，地下病原微生物也可以诱导地上组织的防御反应，反之亦然。很明显，地下组织运输和传递长距离信号到上部组织，导致叶片的代谢变化。我们还注意到，这种代谢变化是依赖于ENM的，其中Fe3O4引起的代谢变化最明显，其次是TiO2和SiO2(图2A)。
为了辨别ENMs的潜在模式，我们进行了单变量分析(单因素方差分析)，发现49种代谢物(表2)在暴露后发生了显著变化。有趣的是，所有的ENMs都导致了一些共同的普遍代谢变化，特别是触发了玉米叶片中氨基酸代谢强烈的扰动，考虑到ENMs具有显著不同的物理化学特性，这一点特别有趣。一些氨基酸(谷氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸)在ENMs中上调或下调(谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸和脯氨酸)(图3)。然而，氨基酸在植物的许多生理过程中起着核心作用，包括提供蛋白质和渗透调节物质的积木，调节离子转运，参与重金属解毒，并影响许多关键细胞酶的合成和活性。酪氨酸和苯丙氨酸是各种次生代谢物的前体化合物，如苯丙素、生物碱和硫代葡萄糖苷，这两种氨基酸的上调是植物体内多种次生代谢产物如苯丙素、生物碱和硫代葡萄糖苷的前体。此外谷氨酸和亮氨酸已被报道作为信号分子并调节重要的胁迫反应基因。因此，氨基酸代谢谱的变化可能表明氮代谢的重新编程，以调节碳和氮的状态，管理植物的生长或发育，或在暴露和/或胁迫时刺激防御。
玉米叶片中的含氮化合物如4-氨基丁酸(GABA)及其前体谷氨酸(Glu)在施用ENMs的土壤中显著积累（图4）。GABA是一种非蛋白质氨基酸，在信号转导、pH调节、氮素储存、植物发育和逆境防御等方面发挥着重要作用，我们推测GABA可能在ENM暴露后的应激信号传导中发挥重要作用。琥珀酸半醛(SSA)，这是由GABA转氨酶形成的，与对照组相比增加了5-8倍(图4)。SSA是GABA代谢的一种线粒体产生的中间产物，在各种生物和非生物胁迫下会在细胞内积累。因此GABA及其上下游代谢物的上调可能表明植物在ENM胁迫下能够感受到根的胁迫，并通过信号转导化合物将信号传导到地上部组织。
除GABA外，另一种含氮化合物腐胺含量在暴露于TiO2(p<0.05)和Fe3O4(p<0.01)的玉米叶片中显著增加(p<0.01)（图4）。腐胺是多胺的重要组成部分，也被报道参与对各种非生物胁迫的响应。除了应激反应，多胺还参与器官发生、胚胎发育、花的开花和发育、叶片衰老和果实发育等生理过程。此外，多胺信号直接参与不同的复杂代谢途径和错综复杂的激素相互作用。另一种被称为精胺及其瓜氨酸前体的多胺信号转导信号直接参与不同的复杂代谢途径和错综复杂的激素相互作用。多胺还参与器官发生、胚胎发生、花的起始和发育、叶片衰老和果实发育等生理过程。多胺信号转导直接参与不同的复杂代谢途径和复杂的激素相互作用，另一种称为精胺的多胺及其瓜氨酸前体在Fe3O4暴露后显著上调。综上所述，玉米中GABA和一些多胺的上调可能是对ENM暴露的一种防御或应对策略。
氨基酸和碳水化合物的代谢通过糖酵解和柠檬酸循环(TCA循环)紧密相连。除了氨基酸组成的改变外，糖酵解和柠檬酸循环的一些中间产物包括丙酮酸、草酰乙酸酯和α-酮戊二酸也是氨基酸生物合成的前体。我们观察到三种TCA循环中间体，柠檬酸，α酮戊二酸和琥珀酸以ENM依赖的方式显著上调或下调(图5)。这说明ENM暴露不仅诱导了氮代谢紊乱，而且还改变了碳代谢。
4玉米叶片中受干扰的生物途径
上述显着变化的代谢物参与了许多重要的代谢途径。我们用MetbraAnalyst4.0对受扰的生物通路进行了表征。这一分析结果表明，在暴露于Fe3O4的玉米植株的叶片中，有11条途径发生了变化(表3，图6A)。值得注意的是，许多受干扰的途径与氮代谢有关。此外，Fe3O4还显著改变了与碳水化合物相关的途径，如TCA循环、糖酵解和糖异生(表3)。TCA循环是植物激素如水杨酸、乙烯和生长素生物合成的关键途径，TCA循环中间体是合成多种氨基酸的前体。TCA循环代谢产物的显着变化提示存在明显的代谢重编程。在暴露于Fe3O4后嘧啶代谢也受到了干扰，嘧啶代谢参与了一些重要的发育过程，如发芽，花粉管的生长以及开花。抑制嘧啶代谢途径可能是植物重新分配能量和资源用于抵抗其他胁迫及其相关过程的一种策略。
TiO2暴露引起了在9条生物代谢途径的改变，其中7条与Fe3O4暴露重叠(表3和图6A)。单独收到TiO2扰动的代谢途径包括甘油磷脂、乙醛酸和二羧酸代谢，其中琥珀酸和异柠檬酸的代谢发生了显著变化。此外，SiO2诱导了6条代谢通路的改变(表3和图6A)。重要的是，在所有ENM中，有三种生物途径通常会改变(表3和图6A)：精氨酸和脯氨酸代谢，甲烷代谢，泛酸和辅酶A的生物合成，而这些代谢途径的改变是氮和碳水化合物代谢的中心。
5 ENMs对根系代谢物的影响
我们用气相色谱-质谱联用技术对玉米根系组织中360种代谢物进行了鉴定和半定量分析。PLS-DA分析结果(图2B)显示了实验组与对照相比呈现了明显的ENM依赖性分离，特别是Fe3O4和TiO2，清楚地表明地下组织中的代谢物剖面也发生了极大的变化。影响代谢变化的大小顺序为Fe3O4>TiO2>SiO2，其模式与叶片相似(图2A)，突出了Fe3O4在暴露的植物组织中引起的最明显的变化。同时单因素方差分析显示只有7种代谢物(高香草酸、磷酸盐、D-甘油酸、甘露糖、β-羟基丙酮酸、鸟氨酸和腺嘌呤)。（图7和表2)与对照相比变化显著，远小于暴露叶组织中显著变化的49种代谢物。考虑到根直接暴露在ENM改良的土壤中，根中的新陈代谢扰动没有叶片中的明显，这一观察结果特别有趣。在这些代谢物中，单糖甘露糖的含量在所有ENM处理中都有所降低。据报道甘露糖控制着酶促抗氧化防御系统的表达，此外磷酸、高香草酸和D-甘油酸的上调以及鸟氨酸和β-羟基丙酮酸的下调是Fe3O4特异的效应(图7和表2)。
值得注意的是，Fe3O4能够比TiO2和SiO2诱导更大的代谢重编程，并且许多代谢物只对Fe3O4暴露有反应。例如，1-羟基蒽醌、4-羟基肉桂酸、咖啡酸和抗坏血酸等活性氧清除剂在Fe3O4暴露的根组织中显著增加(图8)，抗氧化剂酚酸的前体苯丙氨酸也上调。抗氧化代谢产物的上调可能表明Fe3O4诱导了玉米根系的氧化胁迫。我们以前的研究表明，Cu(OH)2NPs和AgNPs也会引起氧化胁迫，暴露后，植物会激活低分子量的抗氧化剂来应对这种胁迫。除了抗氧化剂的上调外，纳米材料Fe3O4还增加了天冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸和缬氨酸等氨基酸的含量。有趣的是，暴露于纳米材料Fe3O4的玉米叶片中丝氨酸和缬氨酸也增加。玉米根中苯丙氨酸和酪氨酸含量在纳米材料Fe3O4处理后也有所增加，其中苯丙氨酸和酪氨酸的含量也明显高于对照，说明玉米根系中苯丙氨酸和酪氨酸的含量也有所增加。如前所述，苯丙氨酸和酪氨酸是防御相关次生代谢物的前体。它们在整个植物组织中的上调表明防御系统的激活。
6玉米根系中受扰动的生物途径
生物代谢途径分析表明，根中只有4条代谢途径受到纳米材料Fe3O4的干扰，显著少于叶中的11条途径。如表4和图6B所示，受干扰的途径包括磷酸肌醇代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、甘油脂代谢和三氯乙酸循环。有趣的是，TCA循环是根和叶组织中唯一被显著破坏的途径。柠檬酸和异柠檬酸是TCA循环中的两个重要中间产物，它们在两个组织中的表达均上调，表明与能量相关的代谢在整个植物中都发生了变化。先前的一项研究表明，脂肪酸和甘油脂代谢在植物防御中都起着重要作用。抗坏血酸和醛酸代谢也是众所周知的抗氧化防御相关途径。此外，磷酸肌醇还作为各种细胞外信号的第二信使发挥作用。结合起来分析，与防御和抗氧化相关的生物通路的激活清楚地表明Fe3O4诱导了显著的应激反应。相反，TiO2和SiO2分别在5条(肌醇磷酸、抗坏血酸/醛酸代谢、甲烷、乙醛酸和二羧酸代谢以及三氯乙酸循环)和2条(肌醇磷酸代谢和三氯乙酸循环)生物代谢途径中引起改变(表4，图6B)。不同于叶片以氮素和碳水化合物代谢为主要靶标，所有供试的ENM都干扰了玉米根中的磷酸盐代谢和TCA循环，说明碳水化合物代谢是根组织中的敏感靶标。
7土壤代谢物组成
根际周围的化学物质组成是由根分泌的化学物质决定的，包括它们的分解代谢物，以及微生物释放的化合物和分解产物。根分泌物是从根组织主动或被动地分泌出来的，具有控制许多非生物和生物过程的功能，包括改变土壤的化学和物理性质，抑制竞争植物的生长，对抗草食动物，调节微生物群落。于GC-MS的代谢组学鉴定和半定量分析了300种土壤代谢物，从亲水性代谢物（糖，有机酸，氨基酸，核甘酸）到疏水性代谢物（脂类和苯丙酸类）。PLS-DA分析结果显示，ENM基团（二氧化硅、二氧化钛和Fe3O4）沿PC1以EMN依赖的方式与对照组明显地分离（图2C）。这表明ENMs明显地改变了土壤代谢谱。有趣的是，Fe3O4和TiO2诱导的代谢反应比SiO2更为明显，这与植物的叶和根中的代谢反应相似。重要的是，溶解的土壤有机质(DOM)是由植物和微生物裂解的细胞和释放的代谢物产生的。尽管DOM的总含量没有变化但土壤代谢物组成的改变可能表明ENM暴露会引起DOM组成的改变(图9)。
单因素方差分析表明，与对照相比，实验组土壤中内醚糖显著增加了1.5-2倍(p<0.0 5)(图10和表2)。内醚糖是一种分泌到根际的生物活性化合物，在拟南芥中与显著增加根长有关。我们推测，内醚糖可能在土壤中作为一种信号化合物来响应ENM的暴露。除内醚糖外，还有一些代谢物，包括亚麻酸、4-羟基肉桂酸、别氨肌醇、倍他酚甘油酸酯、葡萄糖酸、磷酸甲酯、甲基-β-D-半乳糖苷均显著增加(p<0.0 5)。(图10和表2)。这些显著改变的代谢物被分类为糖、氨基酸和酰胺、脂肪酸和芳香酸以及酚类和脂肪酸；如上所述，根系分泌物在植物-植物、植物-微生物(包括病原菌)和植物-病虫害的相互作用中发挥着不同的作用。例如，糖和氨基酸对其他微生物起着趋化剂的作用。此外，据报道，玉米可以上调一些代谢产物，如酚类和类黄酮，以吸引对植物有利的根际细菌，包括固氮和促进生长的种类。一些酚类化合物(绿原酸、咖啡酸和肉桂酸)被报道能增强植物对土传病害的抗性。研究表明，固氮豆科植物根系分泌的酚类化合物是根瘤菌的主要信号分子，而根瘤菌是形成根瘤并将氮还原为氨的细菌。因此，积极选择释放的化合物可能是植物感知或应对ENMS诱导的胁迫的策略的一部分。由于这些代谢物是微生物群落的碳源和能源，因此改变后的土壤代谢物剖面或组成可能会影响土壤微生物群落的组成。需要进一步的土壤微生物分析来验证这一假说。
必须注意的是，观测到的土壤代谢物变化并不完全是根系分泌代谢物的结果，土壤微生物群落的贡献是不容忽视的。特别是那些具有抗菌特性的ENMs很可能会影响土壤微生物的代谢活性，从而触发胞外代谢物释放的上调或下调。许多ENM已被报道影响土壤微生物群落结构和组成，包括AgNPs、TiO2和ZnO。因此，土壤代谢物剖面的改变可能部分归因于微生物被动释放胞外化合物。但是目前的实验设计不能阐明植物和微生物对改变的土壤代谢物的相对贡献。
结论
本研究分析了水稻籽粒在不同发育时期的代谢变化，包括灌浆期籽粒、成熟期籽粒和发芽期籽粒。此外，该研究利用ZS97与MH63杂交获得的210个个体组成的RIL群体破译了MH63和ZS97在不同发育时期籽粒代谢物的差异及其遗传决定因素。结合mQTLs分析结果，该研究对与30个已知代谢物相关的35个候选基因进行了鉴定，其中控制阿魏酰5-羟色胺生物合成和L-天冬酰胺含量的基因通过转基因检测得到了进一步的验证。此外，利用三个时期籽粒中代谢物与农艺性状的相关性，建立了代谢物-农艺性状网络，并结合mQTLs分析和pQTLs分析，揭示了由代谢物和农艺性状组成的复杂性状的遗传基础。
评价
本研究利用广泛靶向代谢组研究与QTL定位技术相结合，并以分子生物学试验加以辅助，显着提高了我们对水稻籽粒代谢组在不同时期的遗传变异和生化基础的认识，并为水稻在保持较高营养水平的同时提高产量的育种策略提供了深刻的见解。
原文网址：https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2019/en/c9en00137a?page=search