Cas9文库是什么？

CRlSPR/Cas9是细菌和古生物菌用来抵抗外来质粒或噬菌体等遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。利用CRlSPR/Cas9技术建立哺乳动物全基因组突变库或者与某类功能相关的基因突变体库，通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选。gRNA文库是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，gRNA文库的建立将在功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面发挥重要的功能。

　　CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选流程分为五步，即gRNA文库选择、gRNA文库扩增、gRNA文库慢病毒包装、gRNA文库筛选、PCR扩增和NGS测序

　　1、gRNA文库选择

　　首先客户选择所需gRNA文库。如果客户根据具体需要提出文库定制（小于300个基因），我们将根据客户提供的基因群信息进行单个基因的gRNA设计，保证每个基因设计3个不同的gRNA，最大程度确保基因功能的突变。我们采用的载体是单/双慢病毒载体，单慢病毒载体是一个载体上同时携带单个gRNA和cas9基因，双慢病毒载体是一个载体上只有单个gRNA，cas9蛋白则由单独携带cas9的载体提供。这两种模式载体均携带有额外的抗性筛选标记。

　　2、gRNA文库扩增

　　上述构建的载体数量较少，不足以进行文库的慢病毒包装和使用。因此，需要对上述载体进行扩增，增加总量。上述gRNA载体构建完成后，我们将这些载体按相同的比例混合成一个pool（即载体混合库），随后将载体混合库使用专用电转感受态，电转扩增培养并收集菌落，并进行扩大培养，最后抽提质粒，即得到了扩增后的载体混合库，也就是文库。

　　3、gRNA文库慢病毒包装

　　扩增后的gRNA文库在慢病毒包装载体的辅助下转染293T细胞，进行慢病毒的包装。由于gRNA文库是由多个不同的gRNA载体混合而成，因此我们获得的慢病毒是混合型病毒库，每个病毒携带单个gRNA载体。

　　4、gRNA文库筛选

　　对筛选的目的细胞进行病毒感染预实验，得到细胞在较低的MOI时感染百分数，以确认感染时gRNA文库的病毒用量。慢病毒库以较低的MOI值感染细胞（确保每个细胞最多进入一个慢病毒），随后根据实验目的而对细胞采用相应的处理，最后经过不同的筛选方式富集细胞。以耐药性基因筛选实验为例，根据前期药物IC50实验，得到药物筛选实验的处理浓度。采用高浓度药物处理感染后的细胞，经过筛选后存活的细胞则具有一定的耐药性，将此群细胞扩增并收集下来，耐药性的来源是CRlSPR/Cas9 gRNA对相应基因的修饰。

　　5、PCR扩增和NGS测序

　　对步骤4筛选中富集下来的细胞进行慢病毒载体的PCR扩增，该扩增片段包含载体所携带的gRNA序列，通过后续的NGS测序，我们可以得到富集细胞中gRNA的富集度，从而寻找到相应的基因，这些基因很有可能参与药物作用过程，因此可作为深入研究的待选基因。

　　实验流程如下：