重组CRISPR/rCas9介导的水稻miRNA基因编辑效率研究

干旱是对全球作物生产力产生不利影响的主要环境压力之一。准确鉴定与干旱反应有关的基因是培育耐旱性更强的作物新品种的必要条件。

图 Osmir818b-过表达和 crispr/cas9mir818b 植株的干旱反应

此前，我们在水稻植株中鉴定出66个干旱诱导的mirna。为了进一步研究miRNAs的功能，我们将重组密码子优化的Cas9（rca9）应用于水稻，其具有针对成熟miRNA序列或成熟miRNA生物合成所需位点的单导rna。对458株T0转基因植株进行分析，以确定CRISPR/rCas9在13个独立靶点mirna上诱导突变的频率和类型。T0代13个单导RNAs靶基因的平均突变频率为59.4%，其中单等位基因（8.54%）、双等位基因（11.1%）和异等位基因组合（39.7%）突变。

突变频率与sgRNAs的Tm温度呈正相关。对于碱基插入，转基因植株中主要检测到一个碱基插入（99%）。同样，一个碱基缺失所占比例最高，但也有相当大比例的病例中有多个碱基被删除。OsmiR171f和OsmiR818b中两个以上碱基的缺失显著降低了相应成熟miRNAs的水平。利用CRISPR/Cas9介导的诱变进一步功能分析证实，OsmiR818b参与了水稻的干旱响应。

总之，本研究表明CRISPR/rCas9系统是水稻miRNA功能缺失分析的有力工具。

Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(24), 9606; https://doi.org/10.3390/ijms21249606

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