快来学学这个单基因新套路发11分顶刊
Cancer-specific mutation of GATA3 disrupts the transcriptional regulatory network governed by Estrogen Receptor alpha, FOXA1 and GATA3GATA3肿瘤特异性突变扰乱雌激素受体α，FOXA1和GATA3调控的转录调节网络
一、文章背景
类固醇激素17β-雌二醇可以激活雌激素受体（ER），而ER-α和转录因子FOXA1、GATA3在乳腺上皮细胞和乳腺癌中构成一个调节网络。其中，GATA3是乳腺癌中最常突变的基因之一，并可以特异性改变FOXA1和ER-α的染色质定位。但乳腺癌中GATA3突变如何影响ER-α在基因组的定位以及下游ER-α和FOXA1的转录网络仍未阐明。
二、分析流程
三、结果解读
1.ER-α，FOXA1和GATA3共定位与活性染色质有关
在无TF突变的乳腺癌细胞系T47D中研究ER-α，FOXA1，GATA3基因组定位：雌激素条件下对ER-α和FOXA1进行ChIP-seq分析，用HOMER注释峰，并进行overlap分析。（图1AB）
将ER-α富集峰分为4组（FDR<0.001）：EFG（ER-α+,FOXA1+,GATA3+）、EF（ER-α+,FOXA1+,GATA3−）、EG（ER-α+,FOXA1−,GATA3+）、ER alone（ER-α+,FOXA1−,GATA3−）。
约50%ER-α峰属于EFG组，约25%ER-α峰属于EF组和EG组，表明配体存在的情况下，T47D细胞中大部分ER-α与先锋因子中的一个或两个结合。（图1C）
用染色质开放性，增强子组蛋白标记（H3K4me1和H3K27ac）和抑制性染色质标记（H3K27me3）水平分析共定位的意义：EFG和EF组中ATAC-seq，H3K4me1和H3K27ac信号强，而EG和ER-α峰中这些活性染色质标记信号较弱。所有组中都可以检测到ATAC-seq信号，表明ER-α定位于开放染色质区域。（图1C）
FOXA1和GATA3仅有26%和24%属于EFG组中，表明ER比FOXA1和GATA3更依赖于转录因子网络。EFG组中ATAC和活跃增强子信号最强，可能提示这些细胞在雌激素条件下增殖。（图1D）
对GATA3峰EFG组临近基因进行GO分析：这些基因在细胞连接，乳腺发育和生殖系统发育中显著富集，表明ER-α-FOXA1-GATA3协同结合的富集对腔细胞是必不可少的。（图1E）
图1.ER-α-FOXA1-GATA3共定位位点的染色质结构
2.GATA3突变诱导ER-α重分布
突变细胞系CR3（T47DR330fs/wild-type）表达的第二锌指结构域（ZnFn2）对GATA3共识序列（WGATAR）的识别非常重要。且大多数R330fs突变是杂合突变。
对GATA3突变细胞进行ChIP-seq分析并用HOMER注释，并用EdgeR注释ER-α染色质差异富集（FDR<0.05 |fold change|>1.5）：CR3细胞中ER-α峰数量减少了约1/3。与wt相比，突变细胞中约62%ER-α峰信号未改变，约20%ER-α峰信号增强，19%ER-α峰信号减弱。（图2BC）
ER-α差异结合对染色质结构的影响：ER-α富集不变的位点K4me1、K27ac和ATAC信号变化很小；ER-α富集增多的位点ATAC和K27Ac信号也增强，K4me1信号变化很小，提示增强子活动增强；ER-α富集减少的位点K4mel和K27ac信号降低，ATAC信号轻微降低，提示部分位点失活。（图2DEF）
图2.R330fs突变诱导ER-α整体重分布
3.GATA3突变改变FOXA1染色质定位
FOXA1 ChIP-seq分析和峰差异分析：T47D细胞和CR3细胞的FOXA1峰数目相近。CR3细胞中约80%FOXA1峰信号未改变，约9%FOXA1峰信号增强，约11%FOXA1峰信号减弱，表明FOXA1重定位频率比ER-α低。（图2AB）
FOXA1结合位点染色质结构的变化：不被GATA3突变影响的FOXA1结合位点增强子组蛋白标记和ATAC信号也无变化。FOXA1富集显著变化的位点，ATAC信号与FOXA1结合改变呈正相关，与其作为先驱转录因子的作用一致。（图3C）增强子组蛋白标记也与FOXA1结合改变呈正相关。（图3DE）
图3.R330fs突变改变FOXA1分布及染色质结构
不同GATA3结合峰中ER-α和FOXA1的结合变化：GATA3峰的改变与ER-α或FOXA1结合的改变呈正相关。（图4）
图4.GATA3峰中ER-α和FOXA1的重定位
4.ER-α和FOXA1重分布改变转录活动
GSEA分析GATA3移码突变对基因表达的影响：CR3细胞中，ER-α增强峰位点附近的基因常上调，ER-α减弱峰位点附近的基因常下调。同样，FOXA1结合的改变与基因表达改变呈正相关。（图5AB）
对ER-α或FOXA1相关基因的GO分析：ER-α或FOXA1降低峰的位点在腺体发育，上皮细胞发育和激素信号传导等通路富集，ER-α结合增加与细胞粘附通路有关，FOXA1增加位点在生殖系统发育相关通路中富集。（图5C）
IPA分析上述差异表达基因的上游转录调节子：ER-α和FOXA1峰减少与配体依赖核受体如PPARG调控的级连信号网络下调有关。ER-α结合增加与AHR、CCL5等通路的激活有关。（图5DE）
Oncomine分析研究乳腺癌中ER-α和FOXA1差异结合的临床意义：GATA3 R330fs突变中的ER-α和FOXA1基因组分布改变导致转录水平的重编码以及更具侵袭性的表型。
图5.ER-α和FOXA1重定位与差异基因表达有关
5.GATA3突变扰乱ER-α-FOXA1-GATA3网络
CR3突变细胞中，ER-α，FOXA1和GATA3峰重叠频率降低。与wt T47D不同，约40%ER-α峰与与FOXA1和GATA3均无共定位。（图6A）
GATA3突变细胞中，EFG峰GATA3结合显著减少，GATA3 alone峰GATA3结合增加。（图6C）EFG峰中，ER-α和FOXA1的结合、染色质开放性以及增强子标志均减少。（图6DE）这些结果说明，GATA3突变首先影响3个因子共结合的位点。
GATA3突变对3个因子的共结合位点的影响：EFG峰中ER-α和FOXA1减少最多。（图6FG）
图6.GATA3突变扰乱ER-α-FOXA1-GATA3网络
ER-α减少峰中，CR3细胞GATA3 ChIP信号显著减少；ER-α增加峰中，CR3细胞GATA3中等增加。同样，FOXA1减少峰中GATA3 ChIP信号也显著减少。（图7AB）这些结果表明，ER-α、FOXA1和GATA3在染色质上存在共结合。
分析差异结合位点的motif频率：虽然Metaplot分析中GATA3 ChIP-seq信号在ER-α和FOXA1增强峰中增强，但ER-α和FOXA1增强峰中，GATA3共同基序（WGATAR）比ER-α和FOXA1减少峰少。（图7CD）
CR3细胞中，与FOXA1结合减少峰相比，FOXA1结合增加相关峰中ER-α motif少，FOXA motif多；与ER-α结合减少峰相比，ER-α结合增加峰中FOXA motif少，ER-α motif多。（图7E~H） motif分析结果与前面结果一致：在ER-α, FOXA1和GATA3三个motif存在的位点，ER-α和FOXA1结合减少峰富集；而在其他转录因子motif存在的位点，ER-α和FOXA1结合增加峰富集。
EFG-peak相关基因在人乳腺癌中的表达：携带ZnFn2突变的肿瘤中，EFG相关基因表达发生改变，不携带或携带其他突变类型的肿瘤中没有这种改变，表明GATA3 ZnFn2突变影响体内ER-α-FOXA1-GATA3调控基因。（图7I）
这些数据共同表明，GATA3 ZnFn2突变扰乱ER-α-FOXA1-GATA3基因调节轴。
图7.motif分析：GATA3突变细胞中EF-α-FOXA1-GATA3复合体减少
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