免疫组化染色与测序数据结合探究特殊肿瘤亚型
1. 引言
今天和大家分享的这篇文章是2021年1月发表在 modern pathology 杂志上的一篇文章，影响因子为5.989，JCR分区为1区。文章的题目是“Molecular and immunophenotypic characterization of anal squamous cell carcinoma reveals distinct clinicopathologic groups associated with HPV and TP53 mutation status”，翻译过来就是，肛门鳞状细胞癌的分子和免疫组化特征揭示与 HPV状态、TP53 突变状态不同组合模式的临床病理分组。作者是如何利用免疫组化染色与测序数据来发现不同HPV状态、TP53 突变状态的组合分组呢？
2. 背景介绍部分
2.1 肛门肿瘤的流行病学和研究背景
流行病学：肛门鳞状细胞癌（SqCC）是肛管最常见的癌症。肛门 SqCC 的发病率在美国呈上升趋势，2019 年估计新发病例 8300 例，死亡 1280 例，分别比 2015 年增加 14% 和 27%。
研究背景: 类似于宫颈和口咽 SqCC，高危HPV 感染是肛门 SqCC 的主要危险因素，在 80-90% 的病例中检测到高危HPV感染。先前的研究表明，HPV 阳性和 HPV 阴性的肛门 SqCC 具有不同的临床病理学特征。例如，与 HPV 阳性肿瘤相比，HPV 阴性肿瘤更常表现出角化和非基底细胞样形态、免疫组织化学 p16 阴性、较差的生存期以及放化疗后残留癌的可能性增加。
2.2 肛门鳞状细胞肿瘤的分子谱研究中发现的问题
2.2.1 p53突变与P53表达异常
先前的研究探究了HPV阳性与阴性肛门 SqCC患者中的分子突变特征，但是这些分子改变对临床结果的影响尚未确定。虽然有些研究认为 TP53 突变或 p53 表达是肛门 SqCC 预后不良的指标；但其他研究发现，当与 HPV 状态一起考虑时，TP53 突变对生存率没有独立影响。
虽然许多研究已经探究了 p53 的表达水平或 TP53 突变在肛门 SqCC 中的预后影响，但很少尝试将 p53 染色模式与 TP53 突变状态相关联。肛门 SqCC 的 p53 免疫染色的特定模式及其与 TP53 突变的相关性尚未确定。因此，在肛门 SqCC 的临床检查过程中，不会常规进行突变分析和 p53 免疫组织化学。
2.2.2 p16
从机制上讲，HPV 通过病毒癌蛋白与宿主细胞周期蛋白的相互作用介导肿瘤进展，包括病毒 E7 诱导的 pRb 抑制导致 p16 上调，以及 E6 诱导的 p53 通过泛素化降解。这为使用 p16 免疫组织化学作为 HPV 阳性的替代标志物提供了合理性。然而，先前的研究表明，p16 免疫染色虽然对 HPV 高度敏感，但可能并不完全具有特异性，而且 HPV 阴性肛门 SqCC 中 p16 阳性的频率还没有得到很好的研究。鉴于 HPV 状态在肛门 SqCC 中的预后意义，目前尚不清楚 p16 免疫组织化学对 HR-HPV 的特异性是否足够高以致于常规放弃确认性 HPV 检测。
此外，尚未研究 p16 和 p53 免疫组织化学染色模式的特定组合相对于 HPV、突变状态和患者预后的重要性。
2.3 本研究想解决的问题
此研究探索了一个含116名肛门SqCC患者队列的临床病理学和分子特征，以评估 HPV 状态、突变谱和组织病理学特征之间的关系，将这些因素与临床结果相关联，并确定 p16 和 p53 免疫组织化学模式。此外，鉴于免疫检查点抑制剂的临床试验在一部分晚期肛门 SqCC 患者中显示出很好的前景，故还补充探究PD-L1 表达的频率及其与 HPV 和突变状态的相关性。
3. 结果部分
3.1 纳入患者的基本情况统计
Table 1: 该研究队列共纳入116名肛门SqCC患者，包括96例高危HPV阳性和20例 HPV阴性。 高危HPV类型包括HPV16（89例）、HPV16和HPV18联合（2例）和HPV33（5例）。常规分析，研究者展示了各组患者的年龄、男女性别比例、随访时间、HIV感染状态、肿瘤分期和治疗方式等等，并进行统计检验。值得注意的是，研究者在这里得出一个结论，在接受治疗后的末次随访时，HPV 阳性 SqCC 患者（74%）比 HPV 阴性 SqCC 患者（35%）更可能无癌（p = 0.0015）。
3.2 HPV阳性和HPV阴性肛门SqCC的突变谱和分子免疫组化特征、形态学特征
Figure 1 : 上方基因突变全景图展示纳入患者的基因突变概貌，中间和下方展示组织学特征。
在纳入的患者中，其中可获得50 例 HPV 阳性和 19 例 HPV 阴性病例的测序数据。上方的基因突变全景图：在 50 例 HPV 阳性肛门 SqCC 病例中的 20 例中检测到突变。在 19 例 HPV 阴性肛门 SqCC 病例中的 11 例中检测到突变。中下部分：展示本研究重点研究的免疫组织化学染色的分子特征和形态学特征。
此外，通过该图可以看见在同一个患者中是否同时发生多个特征，例如在HPV阴性患者中，发生TP53变异的3个患者同时还发生CDKN2A突变。例如在HPV阳性患者中，基因突变与患者P16、P53和PD-L1表达特征的关系，以及这些特征与患者组织切片形态学的关系。
Table 2:汇总在HPV阳性组与阴性组间基因变异的百分比，并进行统计检验。 在 HPV 阳性组中，PIK3CA 是最常见的突变 (24%)，其次是 FBXW7 (10%)、PTEN (6%)、TP53(4%) 和 CTNNB1、KIT 或 KRAS 突变（各 2%） )。在 HPV 阴性组中，最常见的突变是 TP53 (53%)，其次是 CDKN2A (21%) 和 HRAS (5%)。
统计检验的结果阐释：与 HPV 阳性肛门 SqCC 相比，HPV 阴性肛门 SqCC 中 TP53 和 CDKN2A 突变的频率显着更高（分别为 p = 0.00001 和 p = 0.0045）。PIK3CA 异常（突变或扩增）在 HPV 阳性病例中比在 HPV 阴性病例中更常见（p = 0.027）。
HPV 阳性和 HPV 阴性肛门 SqCC 的组织形态学和免疫特征
接下来，对组织切片中可获得的信息进行统计展示。
免疫组化染色结果展示
Table 3: 对组织切片中可获得的信息进行汇总和统计展示。
形态学方面：与 HPV 阴性病例 (20%) 相比，HPV 阳性病例 (35%) 中基底样形态更常见，但没有统计学意义。 p16免疫组化染色：在所有 50 例 HPV 阳性病例以及 20 例 HPV 阴性病例中的 3 例中检测到强烈且弥漫性（块状）p16 表达（p < 0.0001）。 p53免疫组织化学染色：2个 HPV 阳性和 8 个 HPV 阴性病例表现出 p53 的强烈和弥散/融合的核表达（图 3和图 1），这与 TP53 错义突变或错义和移码突变相关（p < 0.0001）。
figure 2-4属于图片展示：
Figure 2: HPV 阴性、p16 免疫组化染色阳性肿瘤的组织学图片。A、C H&E 染色和 B、D 对应的 p16 免疫组织化学染色。
Figure 3: 肛门 SqCC 中 p53 免疫组化染色模式可以区分肿瘤的HPV状态、TP53突变状态。
A. p53野生型肿瘤，少数肿瘤细胞显示出不同强度的核染色，被大多数没有染色的肿瘤细胞隔开。 B. 肿瘤细胞的扩散/强核染色，与TP53错义突变相关的一种模式。 C. 两个 HPV 阴性病例，所有肿瘤细胞均无染色，这种模式与 TP53 无义/移码突变相关。分散的背景炎症细胞的可变染色作为内部对照。 D. 在角化丰富的 TP53 突变病例中，没有角化的肿瘤细胞中存在弥漫性/强染色的肿瘤细胞，通常以基底/外周模式存在，而角化细胞中存在降低的 p53 染色，通常位于中心 肿瘤细胞巢。在这些情况下，具有强 p53 阳性细胞的百分比 > 70%，可以与野生型病例区分开来。
Figure 4: p16 和 p53 免疫组织化学染色结果与HPV状态、TP53突变状态的相关性。p16 和 p53 免疫组织化学染色模式可识别具有不同 HPV 和 TP53 突变状态组合的肿瘤。
p16阳性/p53正常染色模式：A-C展示在所有 HPV 阳性/TP53 野生型肿瘤中鉴定出 p16 阳性/p53 正常染色模式;但这并不是特异性的，在 9 个 HPV 阴性/TP53 野生型肿瘤中的 3 个中鉴定到。
HPV阳性/TP53突变肿瘤：D–F展示在本研究中，仅在 HPV阳性/TP53突变肿瘤中发现了 p16 阳性/p53 异常染色模式。
HPV 阴性/TP53 突变肿瘤：G–I展示在本研究中，仅在HPV 阴性/TP53 突变肿瘤中观察到16 阴性/p53 异常染色模式。
HPV 阴性/TP53 野生型肿瘤：J-L展示p16 阴性/p53 正常染色模式对 HPV 阴性/TP53 野生型肿瘤具有特异性。
3.3 Kaplan-Meier 生存分析探索HPV感染和突变状态在肛门 SqCC 中的预后意义
Figure 5: 探究基因突变、免疫组化、HPV感染状态与患者预后的关系。
A: Kaplan-Meier 生存分析显示，HPV 阳性肛门 SqCC 患者的总生存期明显长于 HPV 阴性 SqCC 患者（p < 0.0001）。与 HPV 阴性 SqCC 患者相比，HPV 阳性 SqCC 患者有更好的无复发生存率(RFS)趋势，但未达到统计学显着性 (p = 0.133)。
B-C: 在所有病例中，TP53 突变状态和异常 p53 染色与较差的无复发生存期（p = 0.0064）和总生存期（p = 0.0103）相关。
D: 当 HPV 状态和 TP53/p53 状态结合在生存分析中时，HPV 阳性/野生型 p53 与最佳总生存相关，HPV 阴性/异常 p53 显示最差的总生存，而 HPV 阴性/野生型 p53 型或 HPV 阳性/异常 p53 肿瘤表现出中等生存概率（p = 0.013）。在 HPV 阴性组中，TP53 突变和异常 p53 染色对总体生存或无复发生存没有显着影响（分别为 p = 0.44 和 p = 0.16）。
Table4: 多因素cox分析展示与预后相关的独立变量。使用 Cox 比例风险多变量分析，HPV 状态（p = 0.0063）、患者年龄（p = 0.0054）、T 分期（p = 0.039）和淋巴结受累（p = 0.044）被确定为总生存期的独立预后因素。性别 (p = 0.416)、手术 (p = 0.794)、放疗 (p = 0.457) 和化疗 (p = 0.476) 不显著。当在具有上述特征的多变量分析中作为变量添加时，TP53 突变和异常 p53 染色与总生存率没有显着相关性（p = 0.36）。在 HPV 阳性组中，HIV阳性和HIV阴性患者的生存率没有显着差异。
3.4 PD-L1表达水平
对 47 例 HPV 阳性病例和 15 例 HPV 阴性病例进行了 PD-L1 染色。这部分属于文章的补充分析部分，未发现阳性结果。
以下为文中的描述部分：
在 HPV 阴性组中，PD-L1 阳性病例的总生存期呈下降趋势（中位生存期 9.8 个月与 40.6 个月；p = 0.064）。
在 HPV 阳性组或整个队列中，PD-L1 表达与存活率之间没有关联。PD-L1 表达与性别、病理分期、突变状态或形态没有显着相关性。
4. 讨论部分
肛门 SqCC 可分为 HPV 阳性组和 HPV 阴性组，每组具有不同的临床、病理和遗传特征。虽然先前的研究已经描述了肛门 SqCC 的分子特征，但对遗传改变的临床意义很少涉及，特别是在 考虑HPV 状态的情况下。同样，很少有研究将突变和 HPV 状态与病理特征（如形态学和免疫组织化学染色）相关联。使用大数据集，此研究比较了 HPV 阳性和 HPV 阴性肛门 SqCC 的遗传改变，并检查了 HPV 状态和突变谱对生存的影响。此外还研究了形态学、HPV 状态、TP53 突变、p16 和 p53 免疫组织化学以及 PD-L1 表达之间的关联，以确定具有临床意义的免疫组织化学特征，这些特征可以预测 HPV 和基因突变状态并预测预后。
参考文献：Zhu X, Jamshed S, Zou J, Azar A, Meng X, Bathini V, Dresser K, Strock C, Yalamarti B, Yang M, Tomaszewicz K, Tjionas G, Mochel MC, Hutchinson L, Bledsoe JR. Molecular and immunophenotypic characterization of anal squamous cell carcinoma reveals distinct clinicopathologic groups associated with HPV and TP53 mutation status. Mod Pathol. 2021 May;34(5):1017-1030. doi: 10.1038/s41379-020-00729-y. Epub 2021 Jan 22. PMID: 33483624.
编辑: 吕琼
校审：罗鹏