软组织会议纪要 | 软组织肿瘤的分子诊断思路和案例分析
5月26日晚上，浙江省人民医院病理科的赵明老师在爱病理平台，给大家带来了的软组织肿瘤的分子诊断的课程。从软组织的诊断思路入手，并结合了多个病例，为大家详尽了介绍了软组织分子诊断的应用。
软组织肿瘤诊断的进展很快，who指南更新的也很快，软组织肿瘤的分类从基于组织分化的分类（WHO 2013），而这些分类具有特定的组织学特征和免疫表型特征，可以用免疫组化的标志物对这些肿瘤做初步的分类。后续演化成从组织结构进行分类（HORNICK JL 2019），到现在发展为基于重现性分子异常的分类（见下图）。
而软组织的分子分类主要是基于染色体核型的分类。第一类是具有单纯染色体核型，也就是单一染色体的变化，纯缺失或者纯重排等。第二类是具有复杂的染色体核型，多个染色体出现异常，而且同时伴随扩增，突变，重排等。
赵明老师认为，FISH最大的应用还是在单纯核型的软组织肿瘤里面，比如像EWSR1对尤文肉瘤的诊断，就是简单明了。而复杂核型的软组织肿瘤，比如多形性平滑肌肉瘤，软骨肉瘤，多形性脂肪肉瘤等，几乎都是复杂核型，很难用单一的分子技术对它做分子诊断，这种使用FISH的诊断意义就不大了。所以对一些核型比较复杂的肉瘤，如果考虑单一基因的诊断，可能诊断思路就不对。
软组织肿瘤的分子分类，还需要注意两个问题：1，同一个肿瘤可能存在多个融合基因或一个融合基因与多个伙伴基因。比如尤文肉瘤大概率出现EWSR1重排，但是也有部分出现FUS基因重排，而EWSR1也不是只有一个伙伴基因，而是很多个不同的。所以有一个诊断思路就是要选择疾病常见的基因重排进行诊断，或者伙伴基因很多的情况下，可以选择断裂探针。2，同一个融合基因/分子突变可能存在于多种不同组织分化，类型的肿瘤中。比如EWSR1-ATF1融合就可以出现在多种不同的疾病里面：透明细胞肉瘤、血管瘤样纤维组织细胞瘤、涎腺玻璃样变透明细胞癌、软组织肌上皮瘤、胃肠道的透明细胞肉瘤样肿瘤/胃肠神经外胚层肿瘤等。所以有时候还是得结合组织学特征和免疫表型等对肿瘤进行综合的判断。
下图是EWSR1和不同的伙伴基因融合所对应的软组织肉瘤：
然后赵明老师还列举了软组织病理学检测专家共识（2019）里的部分基因与对应的疾病的表格，供大家参考与学习：
赵明老师对于软组织的分子诊断的思路提出三个问题。
第一， 是否需要进行分子检测诊断？
1）大多数软组织肿瘤结合临床特征，组织学特征和免疫表型特征可以明确诊断。
2）不是所有的软组织肿瘤都具有可诊断，可检测的特定分子异常。
3）应用与特定分子异常相关的免疫组化染色标志物，比如孤立性纤维性肿瘤有NAB2-STAT6融合基因，因为这两个基因位置太近，FISH技术未必能进行检测。其实也可以用免疫组化的STAT6的标志物进行检测。
4）考虑检测成本，方便性与治疗和预后评估的意义。
第二， 何时需要进行分子检测检测诊断？
1）小活检标本。
2）组织学特征不典型/少见组织学亚型。
3）免疫组化染色结果不理想或与拟诊断的肿瘤有矛盾。
4）需要明确的治疗。比如有些软组织肉瘤需要分子治疗，像NTRK系列等。
5）罕见的年龄或部位。
6）很罕见或少见的肿瘤。
目前的分子诊断技术中FISH是最方便，成本最低的，优先考虑。如果FISH层面无法检测的，可以考虑NGS，之后可以用RT-PCR进行验证。
FISH探针分为：断裂，融合，扩增和缺失四大类。赵明老师对断裂融合探针举例了EWSR1，如果黄色的融合信号点出现了红绿分离即为阳性。而融合探针举例了EWSR1-FLI1，前者标记红色，后者标记绿色，阴性的情况是红绿分离，而二者出现了红绿融合，达到一定比例即为阳性。而扩增基因则举例了放疗后血管肉瘤一般会出现MYC的扩增，可以和非典型的血管病变进行鉴别诊断。缺失探针举例了RB1缺失探针在很多软组织肉瘤中都有出现，包括：梭形细胞/多形性脂肪瘤，非典型梭形细胞/多形性脂肪瘤，多形性脂肪肉瘤等。
第三， 如何选择FISH靶标？
1）根据组织学特点和免疫表型特点拟定诊断和鉴别诊断。
2）根据最可能的诊断选择1个或几个对应的FISH探针。
3）FISH探针结果解读需要结合临床病理和免疫组化染色背景。
4）阳性可支持诊断，阴性不能排除诊断。
5）FISH不能诊断时，选择其他的分子诊断方法如NGS等。
介绍完诊断思路后，赵明老师开始用病例为大家详细介绍，本文筛选了以下四个病例给大家分享：
1）25岁女性，右边肘关节肿块，活检结果:梭形细胞巢状或树状结构，细胞异型性不大，有一个核分裂相。免疫组化结果：CD34阳性，s100阳性，sox10弥漫强阳性。怀疑是透明细胞瘤或软组织恶黑，做了EWSR1断裂，很明确的阳性，最终确诊为软组织透明细胞肉瘤。
2）25岁男性，左颈部淋巴结肿大。做了活检，淋巴结背膜完整，有小圆细胞聚集，看起来像淋巴瘤，但是有些区有粘附性，结节性生长。不像淋巴瘤分散生长的特征。免疫组化结果：CK弥漫强阳性，其他都是阴性。初步诊断为未分化癌，建议查找原发灶。进一步做了CT，发现胰腺附近有肿块。后面继续做了免疫组化EMA和desmin，都为阳性。诊断遇到困难，细胞单一没有多形性，就做了测序，结果发现EWSR1-WT1阳性,进一步做了EWSR1和WT1的fish检测都是阳性，最后结合形态诊断为促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤。
3）49岁男性，左大腿肿块，肌内结节状，树状梭形细胞，血管外皮黏液样的结构。形态像双向性肿瘤，滑膜肉瘤等，免疫组化CK,TLE-1弥漫强阳性，H3K27me3部分表达缺失，S100和SOX10，CD34都阴性，看起来很像滑膜肉瘤。但是形态中有黏液样背景，这是滑膜肉瘤中少见的。然后进一步做了FISH的SYT检测，很明确的阳性结果，最终诊断为滑膜肉瘤，有粘液变性的。
4）58岁男腹盆部肿块，考虑粘液纤维肉瘤。看形态肿瘤边界清晰，肿瘤细胞短梭形，血管外皮黏液样结构，形态整体很像粘液样脂肪肉瘤，但是很多散在的多核细胞，梭形的，有一定的多形性。免疫组化：CD34阳性，stat6阴性，RB1没有缺失，bcl2没有特异性，P16，CDK4，MDM2弥漫性阳。免疫标志物结果像去分化脂肪肉瘤，但是形态上不像。所以进一步做了MDM2的FISH检测，是很明确的簇状阳性，还做了DDIT3，并没有断裂，但是出现了扩增，推测是CDK4扩增造成的DDIT3表现出扩增的结果，为了确定并不是DDIT3扩增，就进一步做了DDIT3扩增探针，结果是阴性的结果。这样就很明确该患者为去分化脂肪肉瘤了。（以下四个探针位置很近，探针位点图供大家参考）
这次课程除了非常详尽的软组织肉瘤的诊断思路以外，更加配合赵明老师工作中遇到的真实案例给大家介绍软组织诊断的完整过程，让人受益匪浅。只是因为时间关系，赵明老师准备的16个案例只讲了一半，期待下一次合适的时机，再与赵明老师更好进行学习与交流。