synNotch平台克服了CAR-T对正常组织的毒性且更加精准靶向肿瘤
回到昨天的内容，这项研究主要想弄清用synNotch受体平台调控CAR的表达能否缓解CAR-T对正常组织的毒性，同时在实体瘤中是否能够接近肿瘤却又不影响抗肿瘤效应。
这篇文章描述的研究分为两个部分，第一部分是研究ROR1 CAR-T对正常组织的毒性，是否普遍存在，决定因素，影响的正常组织和细胞亚型，及可能的机制，本推送这一部分只做简单介绍回顾。
没有预处理清除淋巴的小鼠接受ROR1 CAR-T输注后没有引起毒性但CAR-T细胞只占整个T细胞库的含量极低(不足0.02%)，因此随后用亚致死剂量处理发现ROR1 CAR-T含量增加的同时红细胞(RBC)和血小板(PLT)计数急剧下降，同时ALT和AST水平提高，所有的小鼠在两周内死亡。进一步发现ROR1 CAR-T细胞有着更高的PD-1表达，另外在脾脏、骨髓、外周淋巴结和肝脏分布更高，而在肺、肾脏和胰腺没有区别。对病变的脾脏和骨髓等病变器官进行组织分析，ROR1 CAR-T处理的小鼠的脾脏显示了伴随着有核细胞缺失的弥漫性坏死。进一步分析胫骨，发现骨骺端显著的纤维增生以及造血能力的减弱，另外在RBC和PLT下降的同时也伴随着红系细胞和巨核细胞的缺失。 这就证明了ROR1 CAR-T在预处理小鼠中的毒性致死，后面有进一步的证据表明这种毒性依赖于淋巴清除的强度和T细胞的剂量，不过篇幅限制，这里不再介绍。
由于发现ROR1 CAR-T聚集于造血系统的脾脏和骨髓，接下来研究人员要弄清楚ROR1 CAR-T是否靶向造血系统之外的ROR1+ 细胞。随后研究人员采用了骨髓重建的方法确认了：造血系统中的非造血细胞上的ROR1被CAR-T识别足以引发致死毒性。进一步研究确认了ROR1 CAR-T通过靶向脾脏基质细胞和骨髓MSCs引起脾脏坏死、骨髓外造血失败及细胞毒治疗后的造血恢复障碍。
下面进入第二部分，阐述synNotch平台下对ROR1 CAR-T的改造。
众所周知，解决对正常组织的off-tumor毒性而不影响on-tumor的免疫活性是CAR-T开发中的横亘已久的一个难题。SynNotch受体在识别一个抗原后驱动了特异性识别另一个抗原的CAR的正交转录信号。当单阳性及双阳性的肿瘤细胞分开种植到小鼠上时，这类逻辑门控的表达可以精准限定CAR的特异性识别双阳性细胞。研究发现EpCAM在移植的ROR1+的小鼠乳腺癌细胞中高表达，但是在ROR1+的正常组织中不表达，因此接下来研究是否可作为SynNotch受体使得脾脏和骨髓的间质细胞能够避免ROR1 CAR-T的毒性。
首先构建了编码了myc标签的特异性靶向EpCAM的SynNotch受体的慢病毒同时携带了Gal4-VP64的胞内激活结构域；另一个慢病毒上ROR1 4-1BB/CD3ζ置于Gal4-VP64激活的上有激活序列控制下，同样CAR表达框内包含了tCD19作为检测CAR表达的marker。另外CAR基因的下游包含了组成型表达的BFP来鉴定转化的T细胞。接下来用两个慢病毒共转小鼠CD8+ T细胞并通过检测myc和BFP表达来确认共转效率：~30-60%的T细胞是myc+ BFP+。
随后用synNotch T细胞、ROR1 CAR-T和未转的T细胞分别处理单阳性和双阳性的肿瘤细胞：ROR1 CAR-T能在6hr和24hr内杀死EpCAM+ROR1+和EpCAM-ROR1+的肿瘤细胞，而synNotch T细胞只能识别EpCAM和ROR，细胞裂解活性需要共同孵育24hr（之前研究显示对接上synNotch受体后CAR的完全上调需要12-24hr）(B)。另外EpCAM的存在足以诱导synNotch T细胞上tCD19的表达，而tCD19+ T细胞只有在ROR1抗原存在时候才产生INFγ（C）。
靶抗原的低表达是肿瘤逃逸的机制之一，可能会破坏synNotch T细胞调控CAR表达的能力，为此研究人员分选了高表达和低表达的EpCAM+肿瘤细胞分别用synNotch EpCAM 诱导的ROR1 CAR-T细胞处理，尽管EpCAM表达量差4倍，但是synNotch T诱导CAR表达有着相似的动力学参数和相近的水平，而且体外杀伤肿瘤细胞相当，由此可见抗原的表达高低并不会影响synNotch T细胞的有效性。
接下来验证synNotch T细胞是否能在体内杀伤ROR1+肿瘤细胞而同时对正常组织没有毒性。研究人员在小鼠上种植了ROR1+的肿瘤细胞，待肿瘤明显用Cy预处理后，分别输注未转化T细胞、ROR1 CAR-T和分选的synNotch T细胞，和之前的结果一致ROR1 CAR-T引起小鼠体重急剧下降、贫血及血小板减少和脾脏坏死，但是小鼠接受synNotch T输注后体重的恢复、RBC和PLT的变化及脾脏的形态都和未转化T细胞处理组的及其相似（A、B、C），可见synNotch T并没有引起ROR1+的正常组织的毒性，同时对肿瘤的控制也和ROR1 CAR-T相当，相比另外两组获得的总生存也更长（D、E）。
ROR1 CAR-T在脾脏、骨髓和肿瘤富集并且高表达PD-1，尽管synNotch也被发现存在于脾脏和骨髓，但是数量比ROR1 CAR-T要低出10倍（F、G），相反表达了ROR1 CAR的synNotch T细胞在肿瘤中的数量与ROR1 CAR-T相似，另外液表达了相近水平的ROR1 CAR和T细胞活化、增殖的相关marker，如PD-1和Ki-67（F、G）。
上述这些表明，synNotch T细胞引起了肿瘤选择性的聚集、CAR表达和抗肿瘤效应，同时并没有引起针对脾脏和骨髓中表达ROR1的正常组织的毒性。
接下来就是之前提到肿瘤细胞和正常组织距离问题，因此当肿瘤进入血液循环或者转移到含ROR1+细胞的正常器官时这类策略是否依旧有效，还是一个未知。
为了测试这种空间上的临近，这里研究人员在NSG小鼠身上移植了Raji淋巴瘤细胞（表达hROR1），可以转速进展并转移到血液和骨髓。慢病毒的设计上与之前有几点不同：synNotch受体识别的抗原变为hCD19，同时检测CAR转导的marker改为tEGFR，由于R11 scFv能识别人和鼠的ROR1故不变（A）。
这些数据提示，当肿瘤细胞定位到表达ROR1的正常组织附近时，synNotch T无法有效区分两者，表明两者的空间分离是synNotch策略成功的关键。
【下面是个人的观点，上面这种表达靶抗原的正常组织被CAR-T识别引起毒性+原发肿瘤和表达靶抗原的正常组织在空间上分离+肿瘤又转移到该正常组织附近的情况，三个条件同时满足，更像是一个极端案例，主要是为了测试synNotch T的安全性的阈值范围，也是为了进一步的改造优化更安全的synNotch T，所以对于表达CAR靶向抗原的正常组织来说，synNotch T仍然是安全的。当然该研究所作的所有假设都是只考虑细胞治疗的相关情况，其实现实发生上述情况中肿瘤和正常组织接近时候，完全可以用更换靶点治疗来替代，所以说到底还是为验证synNotch T相关机制而设计】
最后该研究中的synNotch受体还有优化的空间：虽然EpCAM并不表达在ROR1+的骨髓和脾脏，但是在一些上皮组织检测到和ROR1的共表达。这就需要寻找新的适合作为synNotch受体的靶点，这里并鉴定出B7-H3可以作为有价值的候选。B7-H3在ROR1+正常组织几乎不表达，但是在肺癌、乳癌癌和卵巢癌中检测出与ROR1的共表达。
随后设计了特异性识别hB7-H3的synNotch受体来调控T细胞中ROR1 CAR的表达，能在孵育24hr后分泌IFNγ并特异性裂解B7-H3+ROR1+的人肿瘤细胞，而不能杀死B7-H3-ROR1+的细胞。为了检测synNotch T细胞是否可以在体内区分B7-H3+ ROR1+肿瘤和B7-H3- ROR1+正常细胞，研究人员给NSG小鼠静脉输注内源性表达B7-H3和ROR1的乳腺癌细胞。发现ROR1 CAR-T处理的小鼠依旧发生了严重的体重降低、贫血和血小板减少，而synNotch T细胞处理的小鼠中没有发现毒性，但是抗肿瘤活性和CAR-T相当，并且生存延长（A-D）。
就synNotch T细胞而言，主要在肿瘤位点上调CAR的表达，多数PD-1+ Ki-67+，被肿瘤局部激活；很少有ROR1 CAR+的synNotch T在脾脏和骨髓被检测到，基本是PD-1low。相反，ROR1 CAR-T在肿瘤、脾脏和骨髓都能检测得到，全部是PD-1+ Ki67+。
这些结果表明，如果肺癌、乳腺癌的临床研究中用ROR1 CAR-T提示有毒性，那么运用synNotch B7-H3诱导ROR1 CAR表达可能是一个有效的策略。
讨论与小结
目前又很多策略用来降低CAR-T对正常组织的off target毒性，但是很多都没有经过临床前模型的严格验证。其中有一个常见的就是split-signaling，即将CAR-CD3ζ和共刺激结构域分开，两部分只有同时结合抗原时才有持续的抗肿瘤活性，但是需要两个抗原在物理上接近才能同时传递T细胞激活的第一和第二信号。而synNotch T虽然也只是对双阳性细胞有抗肿瘤效应，但是synNotch 受体结合抗原后诱导CAR的表达在时间上有一定延迟，因此对synNotch T的活性来说并不严格并不严格的需要同个肿瘤细胞上表达两个抗原。事实上与两种单阳性的细胞混合也能诱导synNotch T的活性，表明空间临近对于synNotch T识别单阳性和双阳性细胞的程度十分关键。所以说synNotch策略更像是“if/then”而不是严格的“and”逻辑，这样对于两种抗原在肿瘤中异质性表达却依旧有效的诱导synNotch T细胞活性的情况就有了优势。
在上述研究中，逻辑门控的synNotch CAR需要识别EpCAM或B7-H3和ROR1两个信号后才能安全精准的靶向ROR1+ 肿瘤同时对表达ROR1的正常组织没有毒性。形成明显对比的时传统ROR1 CAR-T大量聚积在脾脏和骨髓引发毒性，而在这两个部位发现的synNotch T大多数不表达ROR1 CAR，说明在那里EpCAM或B7-H3的表达很少，同时从也很少有ROR1 CAR+ synNotch T细胞从肿瘤中迁出，这都为synNotch策略的安全性和有效性都提供了严格的测试。