PD-L1的糖基化影响作为biomarker的准确度？
临床上经常通过检测PD-L1的表达来知道anti-PD-1/-L1单抗的治疗，但是很多PD-L1阴性的肿瘤也会对这些治疗产生应答。近期中国台湾的研究人员在Cancer Cell发表文章，发现PD-L1的N连接糖基化阻碍了anti-PD-L1单抗的识别，而移除糖基化可以增强anti-PD-L1信号；进一步发现对患者样本进行去糖基化后可以避免PD-L1检测的假阴性；因此PD-L1糖基化的移除可以增强PD-L1检测的可信度，影响患者分层并更好的预测免疫治疗的效果。下文简单介绍下该研究。
研究背景
通过对阻断免疫检查点PD-1/PD-L1的相互作用近年来成为令人鼓舞的肿瘤治疗策略，FDA相继批准了多个肿瘤的后线甚至一线治疗。尽管如此，越来越多的临床前和临床证据显示，肿瘤组织PD-L1表达的病理学检测结果和anti-PD-1/PD-L1疗效并不一致，不是可靠的预测因子。事实上，基于现有的PD-L1检测方法，一系列临床试验中不管是PD-L1+还是PD-L1-的患者对免疫治疗都有着很好的应答。PD-L1水平和治疗结果的不一致成为大规模应用anti-PD-1/PD-L1进行个体治疗的一大挑战，提示确定PD-L1表达水平来可靠的预测临床结果有着巨大的需求。
包括糖基化在内的翻译后修饰，调控了很多关键的细胞生物学过程，如蛋白质的生物合成和定位，还会通过蛋白结构和相互作用来影响蛋白质功能。需要指出的是，细胞表面PD-L1上N连接的糖基化修饰的分子量占了PD-L1本身的52%(17 KDa/33 KDa)，因此有可能阻碍anti-PD-L1单抗接近多肽抗原，造成IHC结果的不准确，并与治疗结果矛盾。因此本研究旨在探索移除糖基分子能否有助于抗原多肽部分暴露，提升检测准确度并以之为标志物来预测anti-PD-1/-L1治疗的效果。
研究结果
1、 移除N连接的糖基化增强肿瘤细胞株中的PD-L1检测
来自人肺癌(LC)和基底乳腺癌(BLBC)细胞裂解物的PD-L1在凝胶电泳上、迁移到了55KDa附近，提示了重度的糖基化，而用糖苷酶(PNGase F)移除糖基后均一地出现在33KDa附近(结果未显示)。为了确认N连接的糖基结构是否影响检测，研究人员用糖苷酶预处理肿瘤细胞并用未处理的作为对照，随后免疫荧光共聚焦显微镜分析，相比未处理的细胞，糖苷酶处理的LC和BLBC细胞上PD-L1的荧光强度显著提升。
该结果被ELISA确认：随着PNGase F用量的提升，糖基上的化学发光信号(图C，ConA)持续降低，同时FDA批准的28-8 mAb检测PD-L1的信号也随着PNGase F用量提升持续升高。
随后的结合力实验发现，去糖基化后28-8 mAb结合细胞表面PD-L1的能力提升几十倍。
同时，H-score对LC和BLBC细胞株中PD-L1的评分也在去糖基处理后有着明显的提升 。
综上所述，PD-L1的糖基化阻碍了抗体的识别，但是去糖基化处理可以消除这种位阻，增强识别的敏感性，当然这还只是细胞株中的结果。
2、 移除N连接的糖基化增强患者肿瘤组织中的PD-L1检测
随后对患者来源的5类肿瘤的病理学染色进行PD-L1的评估，有无去糖基化处理的PD-L1的H-score差异明显，另外在这些样本中，H-score主要的类群就是基本无改变和提升2倍，占了90%以上。这些结果中显示，IHC染色阳性的患者中有37%-57%在去糖基化后PD-L1显著提升了2倍以上，提示在实际的临床诊断过程中，PD-L1上N连接的糖基化在多类肿瘤中的确严重影响了anti-PD-1单抗的识别。
进一步分析了三个独立的肺癌患者队列，去糖基化处理前TPS主要集中在<1%和1-49%，而接受去糖基化处理之后，结果是TPS≥5%和＞49%显著提升，可以看出去糖基化之后分别16.4%和24.5%，达到临床上可以接受单药治疗标准。另外有趣的是，IHC检测的未经处理的TPS>49%的样本经去糖基化处理后只有一小部分(4.2%)得到提升。所以样本的去糖基化处理可以避免假阴性，提供接受免疫治疗的机会。
3、去糖基化后PD-L1检测的提升与对免疫治疗的应答相关
为了指出PD-L1 IHC结果和患者临床缓解的不一致性，研究人员收集了95分患者不同组织的肿瘤样本，同样分为处理或未经处理，在进行IHC染色，随后分析病理学PD-L1表达与临床缓解的相关性。结果与上文一致：经去糖基化的样本H score也是明显提升。
可以看出，糖苷酶处理组的H-score与PFS存在相关性，未经处理组的样本中则不存在：p=0.018 vs p=0.663。同样的糖苷酶处理组的PD-L1 TPS与PFS也存在相关性，未经处理组的样本中也不存在：p=0.013 vs p=0.480。因此去糖基化处理可以更精准的测量PD-L1表达水平来预测临床结果。
除了PFS外，研究人员还获取了上述患者队列中49例可得的OS数据进行相关性分析，结果也是类似的：去糖基化组OS与H-score或PD-L1 TPS存在相关性，而未处理组则不存在。
因此，去糖基化处理样本能带来更精确的PD-L1表达水平的测量，能够更好的预测包括PFS和OS在内的临床结果。
4、去糖基化处理有利于临床治疗选择
通常在临床的肺癌治疗中，PD-L1<1%的患者是排除在anti-PD-1/anti-PD-L1单药之外的。上述95例患者样本中有44例肺癌，这些样本的糖基化处理同样也是提升了PFS与H-score或PD-L1 TPS的相关性。
接下来看下去糖基化能否把传统IHC检测出的PD-L1 TPS 0-49%中PD-L1+细胞提升至＞49%：【图C】可以看出相比group 1(去糖基化处理前后均0-49%)，group 2(去糖基化处理后的 >49%)的PFS有了明显提升：256.6 day vs 70.1 day p=0.003，提示有16% 的患者可能因为去糖基化处理后TPS>49%而获益。另外group 2(去糖基化处理后的 >49%)和group 3(所有样本的 >49%)的PFS接近：256.6 vs 252.9 day，说明去糖基化处理的PD-L1水平可以更精确的预测临床结果。【图D】接下来研究PD-L1<1%的患者经去糖基化处理后TPS能否提升至>5%(group 5)或>49%(group 6)，研究人员经分析发现：相比group 4(去糖基化处理前后均<1%)，group 5(70.9 vs 175.2 days；p = 0.029)和group 6(70.9 versus 248.0 days；p =0.0006)均有明显提升，也就是分别11%和7%经传统IHC检测PD-L1 TPS<1%的患者经去糖基化处理后TPS分别≥5%和＞49%而可以接受免疫检查点抑制剂的单药治疗。事实上，这个数字和先前文献也报道可以对免疫治疗单药应答的假阴性患者比例接近(9-17%)。
w
4、去糖基化处理带来的抗原修复提升了PD-L1作为生物标志物预测免疫治疗的能力
最后需要研究肿瘤细胞中PD-L1的去糖基化是否增强了PD-L1在临床实践中作为指导anti-PD-1/PD-L1预测可信度。首先以H-score的中位值为临界值将PD-L1 H-score划分为高、低两组。未经处理时 PD-L1 High组并没有发现PFS的获益(p=0.346)；而一旦经过PNGase F预处理，PD-L1 High组的PFS有了显著提升，HR 也降至0.58(p=0.015)；相似的结果也在OS分析中发现，提示N连接糖基的移除增强了PD-L1作为治疗免疫治疗的可信度。
影像结果显示，去糖基化处理后H-score提升2倍以上的2例患者中都观察到了病灶的缩小和消失。
小结一下
看完全文，糖基化影响抗体结合PD-L1，并没有影响PD-1的结合，这是不是anti-PD-1优于anti-PD-L1的又一石锤？