插件 | 点点点，基因差异表达分析~几分钟就掌握了

于是，TBtools - RNAseq 全家桶到位！

写在前面

很久很久以前，TBtools 解决了 RNAseq 数据分析中几个常见问题：

  1. 基因功能注释，NR，SWISSPROT，GO注释等

  2. 基因集功能富集分析，GO和KEGG

去年，通过插件众筹，我们完成了：

  1. 公开可获取测序数据 SRA 的信息整理

  2. Ascp Wrapper，高速下载测序原始数据

  3. SRAtoFastq 格式转换

  4. FastQC 测序质量评估

  5. Trimmomatics 测序数据清洗

  6. Kallisto Wrapper 读段计数与基因表达量估计

仔细观察其中，以前和去年做的事情，中间还差一个东西，那就是基因差异表达分析。

新插件 DESeq2 Wrapper

这几天，协助师弟们完成一些合作课题（....挺多合作的，希望他们得到锻炼的同时，也多少拿个共同作者吧...对我来说没啥用）。其中，让一个师弟尝试跑了下之前我写的差异表达分析流程，报错~~~。查了查，输入文件 ID 的大小写问题。伤心。很久很久以前，我就看差异表达分析这块很不爽。于是，Emmm... 一边等着听课，另一边我就优化了以前的 R 脚本，顺手几分钟就打了一个 TBtools R plugin。以后，这些什么差异表达分析，我就直接本地做了。能点点点，我还搞命令行干啥？

目前该插件已经上传到 TBtools Plugin Store（插件商店），所有用户选中该插件Differential Gene Expression Analysis-DESeq2 Wrapper，点击 Install Selected Plugin即可完成插件安装。（注意：之前推文提到的 Rserver Plugin 需要先安装，不了解的具体翻历史推文）

界面介绍

大体给大家画一画，其实比较简单，就 三个输入文件。

首先是第一个输入文件Counts矩阵，几乎所有读段计数软件，比如HTseq，featureCounts，StringTie，Kallisto等，都可以输出并得到Counts矩阵，大体放到 Excel 长这样。

其次是一个样品归组信息，比如做了一个实验，对香蕉做了低温处理，那么会有 对到和低温两个分组的数据，分别有 3 个生物学重复，那么样品分组信息大体可以长下面这个样子。

注意是三列，尽管第二列看起来其实没啥用，但请还是保留。而第一行，注意到，必须是 #开头，或者直接删掉这一行。
完全可以想象，如果你样品足够多，那么可以有 N 个 Condition，就一直列下去就可以了。一定要注释的是 Sample 名字，比如 sample1，sample2，。。。这些必须大小写都跟上述 Counts 矩阵的列名对应。

而最后则是一个比较信息，我们做基因差异表达分析，肯定是某个条件跟某个条件的两两比较，针对上述只有一个处理和一个对照，那么这个文件就很简单，如下

注意到，支持做 N 中比较组合，只要你的 conditions 数目够多。比如某个课题可能会是多个时间点，大体或许是：

# Sample1 Sample20days 3days3days 5days5days 7days

等等。

具体示例

我写这个插件的时候，随手找了一组数据，并打包成 Demo Data，随着插件分发。所以大伙应该任何一个人都能重复下述分析。把示例数据都放到 TBtools 之后，应该是这个样子。

第一次运行，这个插件会调用 TBtools 的 Rserver 插件，下载并安装DESeq2，需要网络也需要一点时间；但此后每一次运行应该都很快。
运行完成，对于每两个样品的基因差异表达分析，会输出三个文件，如下

分别是

  1. 一个MAplot，大体可以看看差异表达分析结果是否存在异常，绝大多数时候，看都不用看

  2. 所有经过差异表达显著性检验的基因的检验结果，未经过foldchange 和 pvalue或padjust筛选的表格，这个表格常用

  3. 自动筛选的，差异表达显著的基因，筛选标准为|log2fc|>=1 and padjust<=0.05

具体值截取一部分给大伙看看

写在最后

Emmmm，看来 RNAseq 套装，要重见天日了。

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