慢病毒RNA干扰载体构建方法
慢病毒RNA干扰载体pLVshRNA-EGFP、pLVshRNA-Puro和双标RNA干扰载体pLVshRNA-EGFP（2A）Puro。也可以稍作修改用于其他shRNA类RNA干扰载体构建。1、RNA干扰靶点选择pLVshRNA载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体BamHI，EcoRI位点之间。1、选择干扰序列。在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：A 推荐长度为19nt，采用21nt序列也可以取得良好效果。B RNA干扰序列中不包含大于3nt的连续相同碱基。C RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平（推荐GC含量在35%到50%之间）。D 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。E 确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。F 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。★ 设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。这里提供的设计原则可以为您设计RNA干扰序列提供帮助。但是遵循这些原则不能确保设计的RNA干扰序列对目标基因有好的抑制效果。针对一个目标基因，建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好的序列。2、寡核苷酸设计（1）设计正义寡核苷酸链（5’-3’方向）。a）5’BamHI末端GATCC。b）19nt干扰序列正向序列（与目标mRNA一致）。如果干扰序列第一个碱基为C或者T，则在干扰序列前添加一个G，以提供转录起始位点。c）TTCAAGAGA（环状结构）。d）19nt干扰序列的反向互补序列。f）TTTTTTG。（2）设计反义寡核苷酸链（5’-3’方向）。a）去掉正义链寡核苷酸中5’GATC。b）将步骤a )中得到的序列做反向互补。c）在步骤b)中得到的序列的5’端加上碱基AATT。一个设计好的例子见下图：
注：箭头所指为干扰序列第一个碱基为C或T时添加的碱基。干扰序列第一个碱基为A或G时无需添加。3、载体构建对于实验中的很多步骤，您可以使用您实验室中常用的方法，或者您的实验经验证实有效的方法。对于酶切、DNA纯化以及转化等步骤，您可以参照《分子克隆实验指南》进行，也可以参照您购买的试剂盒中生产商提供的使用说明进行。步骤1：退火寡核苷酸链根据我们的经验，脱盐纯化的寡核苷酸足以满足连接和克隆需要。但是不同供应商提供的引物纯度差别很大，如果您连接和克隆遇到困难，可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化的引物，或者使用其他供应商提供的引物。用水将寡核苷酸稀释为100 μM。按以下体系配制退火反应体系：正义寡核苷酸（100 μM） 5μl反义寡核苷酸（100 μM） 5μlNaCl 100 mMTris-Cl pH7.4 50mM加水补足 50μl将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR以上，运行以下程序：90℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20℃长期保存。步骤2：酶切载体用BamHI和EcoRI双酶切2μg载体。酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。通常情况下用大约20-30单位的酶大约3小时可以酶切完全。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的载体体积稀释为100ng/μl。★ 对线性化的载体进行去磷酸化处理是没有必要的。充分酶切后的载体具有不匹配的末端，一般不会发生载体自连。步骤3：连接用水将退火后寡核苷酸稀释100倍备用。按照以下体系配制连接反应体系：T4 DNA 连接酶 5U线性化载体 2μl稀释后寡核苷酸 1μl10×连接酶Buffer 1μl加水补足 10μl接连反应条件和时间参照您购买的连接酶说明书进行。我们一般采用MBI连接酶，22度反应30分钟。通常说明书要求反应完成后加热灭活连接酶，在我们的实际操作中是否灭活连接酶对下面的转化实验没有影响。步骤4：转化大肠杆菌感受态及克隆鉴定用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常见的大肠杆菌感受态细胞（例如Top10，DH5α）均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制备感受态细胞。转化方法按照供应商的说明书或者您实验室中常用的方法进行。在氨苄抗性的琼脂平板上37℃培养转化后细菌，大约14-16小时后，平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。鉴定方法可以采用PCR鉴定。★ 由于插入的片段仅几十bp，鉴定时用未酶切的空载体作为阴性对照是必要的。克隆PCR鉴定：pLVshRNA-eGFP载体采用引物U6F：GACTATCATATGCTTACCGTAACT和U6R(G)： ATGGGCTATGAACTAATGACC进行鉴定，空载体扩增产物长度为142bp，阳性克隆扩增产物为190bp左右。pLVshRNA-Puro和pLVshRNA-EGFP(2A)Puro载体采用引物U6F：GACTATCATATGCTTACCGTAACT和U6R： GGTGGATGTGGAATGTGTG进行鉴定，空载体扩增产物长度为212bp，阳性克隆扩增产物为260bp左右。鉴定的阳性克隆可采用U6F引物测序。