免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液:收集4x107细胞,用PBS洗涤后,加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂),充分混匀,冰上裂解30 min;4℃,12000 rpm离心10 min,收集上清液。
2) 免疫共沉淀:在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads,4℃翻转混合孵育1 h进行预清除,离心后取0.5 ml上清液,加入3 μg诱饵蛋白X抗体,另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG抗体作为对照,4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads,4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次,每次5 min。
3) Western Blot分析或MS质谱分析:沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer,煮沸10 min后离心取上清,用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析,以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析,以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。
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