子宫颈癌是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，严重威胁着女性健康[1]。高危型人乳头状瘤病毒（high risk human papailloma virus，HR-HPV）持续性感染是子宫颈癌及癌前病变发生的主要病因，基于高危型HPV检测是较为理想的宫颈癌筛查工具[2-3]。
目前，HPV核酸检测已在临床实验室广泛开展，也常用于社区宫颈癌高危人群的筛查与分流。由于HPV检测试剂种类众多，某些实验室对HPV检测技术的选择仍存在困惑或选择不恰当，HPV检测报告的结果解读也存在争议，为此，本文总结了HPV核酸检测技术的发展现状并剖析了不同种类HPV核酸检测技术的应用特点和应用场景。
根据检测原理不同，HPV核酸检测技术可以归为两大类，即信号放大技术和靶标扩增技术。1.信号放大技术：信号放大技术是指HPV检测中HPV的DNA未被扩增，而是通过与HPV DNA结合的化学信号进行放大的方法，这类HPV核酸检测试剂主要包括第二代杂交捕获法（hybrid capture 2，HC2）和care HPV技术以及Cervista TM HPV test和基于原位杂交法（in situ hybridization，ISH）的一些试剂。HC2检测方法是首个获得美国食品药品监督管理总局（Food and Drug Administration，FDA）认证的HPV检测方法。HC2检测原理是一种采用免疫技术并通过化学发光使信号放大的检测方法，可以检测13种HR-HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68），不具体区分型别。该试剂在检测宫颈上皮内瘤样病变2 级（cervical intraepithelial neoplasia grade 2， CIN2）及以上（CIN2＋），具有高的灵敏度（87％～96％）和阴性预测值[4]，因此该方法已成为各种HPV检测技术的参照试剂[5]。Care HPV是一种快速HPV DNA检测方法，其检测原理为抗体结合顺磁性磁珠技术，该检测方法可检测14种高危HPV型别（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）[6]。与传统的HPV检测方法相比，该方法的优点在于操作简便易行，对取样人员及实验室条件要求较低，检测时间较短。Cervista HPV检测试剂的主要原理是基于Cleavase酶切信号放大法检测高危型HPV。在等温反应下，由Cleavase酶特异性识别并切割分子结构，通过分子杂交和化学信号放大，从而直接检测特定的HPV DNA序列。该产品拥有Cervista HPV HR和Cervista HPV16/18两种试剂，FDA于2009年批准的这两种试剂在宫颈筛查中可用于ASCUS分流和细胞学联合筛查[7]。2. 靶标扩增技术：靶标扩增技术主要通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 扩增结合其他的方法检测核酸，是应用最广泛的一种方法。（1）通用引物聚合酶链反应法（polymerase chain reaction，PCR）：大多数通用引物主要针对高度保守且在不同型别中突变频率较低的L1区[8]。目前商品化的检测试剂包括：①Linear Array检测试剂采用PGMY09 / 11系统[9]进行扩增分型。该方法操作简便易行、价格低廉，但需要相对较大的PCR片段，特别是对于一些断裂的、不易于扩增的DNA样本如福尔马林固定的标本和石蜡包埋的标本等，且该方法不能对HPV进行特异分型，也不适用于HPV多重感染[10]。国产多种试剂均是通过优化GP5+ / GP6+ PCR系统[11]进行扩增检测。HPV检测试剂INNO-LiPA HPV genotype assay是通过SPF10 PCR体系[12]结合反式杂交法，建立了对32种不同型别HPV分型的检测试剂。（2）荧光定量聚合酶链反应技术（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）：该方法采用针对某个HPV基因型的特异引物及探针扩增病毒DNA序列。这种方法的灵敏度和特异度较高，可以进行病毒载量测定，也可以明确HPV的具体型别，不需要进行后续分析，但单通道检测每个反应只能检测1种HPV型别，如需检测多个型别，则要在不同的反应体系中进行。Cobas 4800检测试剂是这种检测方法的典型代表，其检测原理是基于特异性PCR荧光探针法的检测试剂，在单个反应中，包含一组针对HPV L1区的特异性引物和人β-球蛋白的基因，可以同时检测14种高危型HPV，包括HPV16、18、其他12种HPV类型（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68），可以对HPV16及18具体分型，而对其他12种HPV类型则不能进行具体分型，人β-球蛋白的基因为内对照（internal control，IC），该方法已于2014年通过美国FDA的认证[13-14]。一些国产HPV分型检测试剂检测方法均属于此类。与Cobas 4800检测技术不同的是，这些检测技术是在单一反应中，设计3种或4种特异性引物，检测4个通道并分析出具体型别[5]。由于国产HPV检测试剂种类繁多，结果判读标准不尽相同，通常以试剂说明书为依据进行结果判读。（3）基于PCR的后续分析方法：该方法先使用针对HPV序列较为保守的位置的通用引物进行PCR扩增，之后再对扩增产物进行后续分析即可确定HPV的基因型别，并且可以同时检测多种HPV基因型。广东潮州凯普生物公司的导流杂交法（HybriMax）是HPV基因型分型检测方法，集导流杂交与基因芯片技术的优势于一体，能同时对21种HPV基因（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81）进行分型，且可判断多重感染。（4）mRNA扩增技术：研究表明，HPV RNA比HPV DNA能够更加精确地甄别发病高风险人群或宫颈病变的进展，因此高危型HPV的检测也可以针对病毒的mRNA来进行，E6 / E7 mRNA可能是宫颈癌筛查的有效生物标志物[15]。Aptima（transcription mediated amplification，转录介导的扩增技术，即TMA技术）即针对于E6 / E7的mRNA进行的，拥有Aptima HPV和Aptima 16、18 / 45两种产品，于2011年获得美国FDA的批准，是第1个获FDA认证的HPV mRNA检测技术，Aptima HPV可以检出14种高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68），但不能够具体分型。Aptima16、18 / 45可以区分检测HPV16型，对于18/45型的HPV感染仅能混合报告阳性或阴性，而无法区分具体的型别。该方法的检出限为24~488拷贝/ mL，S/CO值为0.5。由于Aptima不是采用宫颈脱落细胞内的保守基因进行内质控的，因此，该方法的HPV检测存在交叉反应。而且由于RNA的不稳定性，标本不宜长期保存。（5）二代测序（next generation sequence，NGS）：NGS检测HPV DNA是发展较快的一种技术，可进行全基因组测序或特定区域的序列测定。该技术可提供给每例患者不同的数据，包括感染病毒类型、病毒载量、病毒状态和病毒插入位点等。尤其对于多重感染的样本，能够准确检出低拷贝的HPV亚型[16]。华大基因推出了基于NGS平台的HPV分型基因检测技术-SeqHPV，可对14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)和2种低危型HPV(6、11型)进行精准的分型检测。我国自2000年开始使用HPV检测技术，国家药监局（NMPA）批准了超过100种方法/产品用于HPV核酸检测，例如，实时荧光聚合酶链反应（QPCR）法、杂交捕获法、等温扩增及基因芯片法等。在众多的HPV检测试剂中如何选择适用的试剂是大家较为关注的问题。NMPA关于“人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂技术审查指导原则”以及国际相关研究指出：初筛试剂应选择适当阳性阈值[17]，并在30到60岁筛查人群队列中（包含>60例CIN2 +病例）验证其筛查高度病变（HSIL）的灵敏度和特异度（参考值为0.90和0.98）[18-20]。因此，在选择HPV核酸检测试剂时，应与相应的预期用途相结合。同时考虑中国庞大人口的公共卫生需求以及成本效益，可基于卫生资源而选择不同初筛方法。1. HR-HPV检测的临床意义：HPV是一种常见病毒，耐酸碱，外界存活可达1周，主要通过性接触传播。80%的女性一生都会感染HPV而且不会表现出任何症状，70%～90%的HPV感染无症状，在1～2年内可自行转阴，仅有5%～10%的HPV 感染会持续[21]。高危型人乳头状瘤病毒（high risk human papailloma virus，HR-HPV）包括14种：HPV16/18/31/33/35/39/45/ 51/52/56/58/59/66/68。HR-HPV持续感染导致几乎所有的宫颈鳞癌[22]，从HPV感染进展为浸润性宫颈癌通常需要20多年。低危型人乳头状瘤病毒（low risk human papailloma virus，LR-HPV）主要包括HPV6/11/30/42/43/44/61 等，其中HPV6/11 感染可引起90%的生殖器疣[21,23]。我国宫颈鳞癌患者中，HPV16 最常见（76.6%），其次是HPV18（7.9%）、HPV31（3.2%）、HPV52（2.2%）和HPV58（2.2%）；子宫颈腺癌患者中常见的感染型别为HPV16、18型[21,23]。2. HR-HPV检测在感染人群分流中的意义：HR-HPV检测技术虽然能够较为灵敏地筛查出宫颈癌和癌前病变，但特异度和阳性预测值却不高[24]，常常会造成不必要的阴道镜转诊和（或）过度诊断及治疗，既浪费卫生资源，又对妇女身心造成不必要的伤害。因此，对HPV初筛阳性妇女的分流必不可少。我国一项纳入了60,732例受试者的大样本研究推荐，农村地区可采用基于杂交捕获原理的高危型HPV检测，对于HPV阳性（HPV不分型）采用细胞学、VIA/VILI等分流，或直接阴道镜检查；城市采用FQ-PCR、等温扩增等高危型HPV分型技术，对于HPV16、18 阳性可直接转诊阴道镜，其它12种HPV 阳性采用细胞学分流[25-26]，或采用p16/Ki-67双染技术分流[27-28]。由于HPV阳性人群的分流方法尚无统一意见。采用何种方法分流HPV阳性人群既要考虑分流策略效果，也应根据不同国家和地区经济发展情况因地制宜。3. HPV检测结果解释：HPV检测结果一般包括三类：无效结果、阴性结果、某一个或某几个HPV型别阳性结果，检测结果判读均参照试剂说明书。对于无效结果需重新复检；对于阳性结果提示有HPV感染。样本管中靶基因检测结果应结合对照品（质控品）以及和内标的检测结果，对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。检验结果的解释应以临床试验结论为依据。如有适用的临床诊疗或筛查指南，则应在此项下引用，相应检验结果的解释应符合相关指南的要求。综上所述，尽管HPV核酸检测技术众多，在实际工作中需结合预期用途及卫生资源状况选择最适用的HPV核酸检测技术，最有效地降低女性宫颈癌的发病率。
注：本文来源于《临床实验室》杂志2021年第5期“分子诊断”专题
