转录激活技术原理
转录激活概述
CRISPR/Cas9系统是一种由RNA引导Cas9蛋白对靶基因进行修饰的技术。将Cas9中切割域突变,就会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性,但不影响其与DNA的结合能力,这种失去DNA切割活性的Cas9蛋白被命名为 Dead Cas9(dCas9) 。利用gRNA介导dCas9能够精确识别靶基因的特点,将dCas9蛋白与具有转录激活功能的蛋白结构域融合,可构建具有转录激活活性的系统,简称CRISPRa。
将dCas9与转录活化域VP64融合,表达的融合蛋白在gRNA介导下结合到启动子区,并通过VP64激活区域与PolII结合,激活基因的转录,提高内源目标基因的表达。
与传统转基因相比,CRISPRa系统是通过激活细胞内源基因表达来提高目标基因的表达量,它不需要转入外源DNA,降低了由于转基因造成的基因组不可逆转突变的风险。另外,结合gRNA文库,可同时激活多个基因的转录与表达。此前Gain-Of-Function筛选主要是通过cDNA文库实现,但由于部分cDNA克隆难度较大致使cDNA文库覆盖率不完全;同时cDNA文库并不能涵盖每个基因的所有转录本;基因的表达也会受到细胞内部元件的调控。利用dCas9-VP64-gRNA系统进行的高通量筛选可在同一个启动子上设计多个gRNA来提高基因的转录活性,基因转录本也会更为全面。已有研究表明,利用CRISPR/Cas9系统选择性的上调基因表达,可以用来诱导干细胞的分化或重编程、刺激组织再生、补偿遗传缺陷、激活已经失活的抑癌基因、进行基因功能筛选以及合成基因回路。
转录激活技术原理
CRISPR/Cas9系统转录激活原理:dCas9与转录活化域VP64融合,表达的融合蛋白在gRNA介导下结合到启动子区,并通过VP64激活区域与PolII结合,激活基因的转录。