Nat Genet | 基因组水平NK细胞与肿瘤细胞的相互作用
撰文：huacishu
IF=38.334
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亮点：
1、作者整合了PRISM和CRISPR研究，以确定与NK细胞敏感性或耐药性相关的分子特征。
2、该研究结果为理解NK细胞与肿瘤细胞的相互作用提供了深刻的见解，并可能有助于为当前和未来应用NK细胞治疗人类肿瘤提供重要的参考信息。
Dana Farber癌症研究所Mitsiades教授团队在国际知名期刊Nat Genet在线发表题为“Genome-scale screens identify factors regulating tumor cell responses to natural killer cells”的研究论文。为了系统地确定人类肿瘤细胞的分子特征，并且这些特征往往决定了它们对人类自然杀伤（NK）细胞的敏感程度，文章量化了数百个分子注释的“DNA条形码”实体肿瘤细胞系的NK细胞反应性，并在几个实体肿瘤细胞系中应用CRISPR的基因编辑屏幕，从功能上探讨肿瘤细胞中的哪些基因调节对NK细胞产生反应。在这些正交试验中，NK细胞敏感的肿瘤细胞往往表现出“间充质样”的转录程序；染色质重塑复合物的高转录特征；高水平的B7-H6（NCR3LG1）以及低水平的HLA-E/抗原呈递基因。重要的是，NK细胞敏感肿瘤细胞的转录特征与临床样本中的免疫检查点抑制剂（ICI）耐药性相关。这项研究提供了调节肿瘤细胞对NK细胞反应机制的综合图谱，为NK细胞免疫治疗的未来生物标记物驱动的应用提供了参考。
在实体肿瘤细胞系中同时分析相对抑制率（PRISM），每个细胞系具有不同的“DNA条形码”，在不同的时间点和效应物与肿瘤（E:T）的比率暴露于新鲜分离的健康供体来源的NK细胞，以量化它们对NK细胞的细胞毒性效应的反应（图1a）。通过E:T比率计算每个细胞系和时间点的相对肿瘤细胞活力曲线下面积（AUC）（图1a，b）。选择AUC高与低的品系（图1b，c）进行单独检查（非混合分析），得出与混合PRISM研究一致的结果。在单变量分析中，AUCs的排序列表与每个基因的转录水平相关。
为了补充PRISM研究，作者在具有不同NK细胞敏感性的结直肠细胞系上进行CRISPR基因编辑筛选；HCT15、SW620和HT29（图2a、b）分别单独培养，并用来自不同供体的体外扩增NK细胞处理。与未经治疗的对照组相比，在NK细胞治疗后存活的肿瘤细胞中，单导向RNA（sgRNA）基因富集。接着将重点放在与NK细胞敏感性相关的基因上，这些基因在至少一个CRISPR筛查中与转录水平和sgRNA富集呈负相关；在至少一个CRISPR筛选中，与抗性相关的基因的转录水平与AUC和sgRNA缺失正相关。
蛋白质组学和转录谱的主成分分析（PCA，图3a）确定了两个主要的细胞系簇，它们表现出上皮样（例如，CDH1表达）和间充质样（例如，VIM，ZEB1，ZEB2表达）特征：这两个细胞簇也表现出绝大多数基因的差异表达（图3b-d），重要的是，它们分别表现出较高和较低的平均AUC（图3b）。AUC在不同肿瘤类型中的分布广泛重叠，但在AUC中位数较低的肿瘤类型中，“间充质样”细胞系高度富集的肿瘤类型往往过度表达（图3e）。值得注意的是，即使是来源于通常被认为是上皮来源的肿瘤的细胞系也可能表现出“间充质样”转录特征，因此对NK细胞产生反应的可能性更大。接着对来自同一患者源性卵巢肿瘤的两个不同克隆进行了这一测试，它们分别表现出上皮样（低VIM（vimentin），高CDH1（E-cadherin））和间充质样（高VIM，低CDH1）转录特征，并发现后者确实对NK细胞毒性更敏感（图3f）。
PRISM和CRISPR的整合研究确定了其转录水平与所有PRISM细胞系的AUCs相关的基因，并且在至少两个（图4a，b）被确定为NK细胞反应的调节因子。CRISPR鉴定出额外的基因在功能上与肿瘤细胞对NK细胞的反应的调节有关，而它们的转录水平与AUC无关。尽管少数基因的突变与较低（如PTPN13、B2M和MET）或较高（如CDKN2A和KRAS）的AUC相关，但并没有发现任何个别基因的突变状态与AUC相关。由于B7-H6是一个显著的与NK细胞敏感性相关的基因，因此作者进一步研究了它的功能。与相应的对照组（sgCtrl）相比，B7-H6敲除（sgB7-H6）的不同细胞系对原代NK细胞的体外细胞毒性降低（图4c，d）。在HT29细胞中，B7-H6蛋白的表面表达是不均匀的，它们暴露于NK细胞导致B7-H6 细胞相对丰度的剂量依赖性降低（图4e）。接着检测了B7-H6在免疫功能低下的NSG小鼠体内的作用，这些NSG小鼠接受了对侧皮下注射SW620细胞，并进行了B7-H6基因敲除。对照组只注射肿瘤细胞，而治疗组注射NK细胞和肿瘤细胞的混合物（图4f）。在NK细胞暴露的sgB7-H6肿瘤中观察到肿瘤生长，而在sgCtrl对应物中，肿瘤生长不可检测或体积小得多（图4g，h）。与正常组织相比，B7-H6转录物在胃癌、结直肠癌和乳腺癌中高表达，提示以B7-H6为靶点的NK细胞治疗可能与这些肿瘤类型的患者亚群特别相关。
抗原呈递途径基因，包括MHCⅠ类分子，与IFN-γ诱导的JAK/STAT信号紧密关联，在TCGA数据集中高度相关。在MHC I类基因中，HLA-E在SW620和HT29细胞中具有最显著的sgRNA缺失特点（即对NK细胞的致敏作用）（图5a）。假设HLA-E是MHCⅠ类/抗原呈递机制基因中NK细胞抵抗的关键决定因素。对于这个假设，作者观察到HLA-E和HLA-A/B/C都表达（尽管后者的水平相当高）在缺乏IFN-γ的情况下，进一步由IFN-γ诱导；这种诱导被STAT1基因敲除而消除（图5b）。STAT1或HLA-E基因敲除的肿瘤细胞增加了NK细胞敏感性（图5c），表明NK细胞反应性的这些变化主要是由于缺乏HLA-E造成的。
为了研究B7-H6和MHC I型分子在转录物和表面表达水平上的关系，将PRISM细胞系处理成具有不同表面表达这些蛋白质的亚群，将其各自“条形码”的测序读取计数转换为表面表达蛋白得分（图6a）。B7-H6和HLA-A/B/C的表面蛋白得分分别与B7-H6和B2M的转录水平表现出最高的相关性（图6b，C）。B2M转录水平可以作为MHCⅠ类复合物表面表达的替代物。实际上，B2M突变株具有较低水平的B2M转录物，但不具有HLA转录物。B7-H6蛋白得分高，HLA-A/B/C低，与AUC低相关。有趣的是，这两组之间的重叠是显著的（图6d）。CCLE和TCGA数据表明B7-H6和B2M或HLA-E的转录水平呈负相关，与PRISM中NK细胞的细胞毒性有关。
基于基因水平研究，作者在基因集/通路水平上检测了肿瘤细胞对NK细胞反应的分子决定因素。基因集富集分析表明，与NK细胞抗性相关的基因在上皮样基因特征、抗原提呈机制基因及其相关途径方面得到富集，这与CRISPR研究中MHC I类基因的sgRNA缺失一致。相反，与NK细胞敏感性相关的基因富含间充质样基因特征和染色质重塑复合物（HDAC、SWI/SNF和Polycomb），与CRISPR研究中RBBP4和ARID1A的sgRNA富集一致。AUCs与B7-H6、GSEA富集核心基因与染色质重塑和抗原呈递特征的关联在细胞系（图7a）的分析中得到证实，并且在仅包括上皮样或间充质样细胞系的分层分析中得到证实。此外，对TCGA转录水平的分析显示，与上皮来源的肿瘤相比，间充质来源的肿瘤表达较低水平的抗原呈递基因和IFN-γ应答基因，提示上皮样转录特征与抗原呈递或IFN-γ应答水平之间存在联系。在检测的TCGA数据集的所有肿瘤类型中观察到染色质重塑基因与HLA-E之间的负相关，或HLA-E与抗原呈递基因之间的正相关（图7b）。在此基础上，进一步探讨了染色质重塑的干扰如何影响抗原提呈基因的表达和肿瘤细胞对NK细胞的反应。事实上，这些特征在用各种广谱组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂处理的细胞系中被逆转（图7c），并且在K562白血病细胞的CRISPR研究中，一些染色质重塑基因的敲除导致MHC I类水平的表面表达增加（图7d）。重要的是，用HDAC抑制剂预处理SW620细胞导致HLA-E的STAT1非依赖性上调；B7-H6下调；对NK细胞敏感性降低。
假设与NK细胞反应性相关的转录特征的收集可能与ICI反应的降低有关。通过检测五组ICI治疗的黑色素瘤患者的ICI耐药肿瘤样本（无应答者与应答者或治疗后与治疗前）的转录谱来解决这一假设。在两种设置下（图。7e），与NK细胞敏感性相关的转录特征在对ICI无反应的患者样本中富集。事实上，PRISM和CRISPR定义的与NK敏感性相关的基因的转录特征以及间充质样和染色质重塑特征被上调，而与NK细胞抵抗相关的转录特征，包括上皮样和抗原提呈机制基因，在抗ICI肿瘤中表达下调（图。7e和8a，b）。此外，抗ICI肿瘤的NK敏感性基因得分较高。与这些结果一致，在TCGA中，与NK抗性相关的基因组在UPS中表现出正富集，而在LMS肿瘤中，NK敏感性基因组表现出负富集（图。7f和8c）。总的来说，这些观察结果表明，对其他形式的免疫治疗产生耐药性的分子特征并不一定与对NK细胞的耐药性相关，甚至可能与对NK细胞的反应性增强有关。
以NK细胞为基础治疗的临床研究已经提供了有前景的临床结果（例如，嵌合抗原受体NK细胞对复发或难治性CD19阳性血液恶性肿瘤具有临床活性），通过生物标记物驱动的“个性化”给那些肿瘤表现出与NK细胞敏感性相关的分子特征的患者使用这些疗法，这可能会进一步改善肿瘤病情发展。为了实现这一目标，作者整合了PRISM和CRISPR研究，以确定与NK细胞敏感性或耐药性相关的分子特征。该研究结果为理解NK细胞与肿瘤细胞的相互作用提供了深刻的见解，并可能有助于为当前和未来应用NK细胞治疗人类肿瘤提供重要的参考信息。
教授介绍
Mitsiades博士是Dana Farber癌症研究所医学肿瘤系哈佛医学院医学助理教授，他的研究重点是解释和克服肿瘤细胞对药理学和免疫疗法的抵抗机制。他获得了医学博士和希腊雅典大学医学院的基础医学和临床医学硕士学位。他还获得了哈佛医学院的医学硕士学位。Mitsiades教授还在国际权威期刊blood、Cancer Res、Cancer Cell上发表了多篇文章，主持撰写了多部相关专业著作。
参考文献
Sheffer M, Lowry E, Beelen N, et al. Genome-scale screens identify factorsregulating tumor cell responses to natural killer cells. Nat Genet.2021;10.1038/s41588-021-00889-w. doi:10.1038/s41588-021-00889-w
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