派森诺告诉你低细胞数量研究解决方案

单细胞组学改变了我们对于细胞异质性的研究与其动态重构的理解。多种降维、分群方法的开发可以让我们迅速的分辨出不同的细胞类群。随着研究转向对复杂的人体组织甚至整个生物体的分析，通过大规模的高并行集群运算可以揭示罕见和动态的细胞状态。目前，随着技术的成熟，市场上诸如10xgenomics、BD等平台的单细胞产品在多个物种中都获得了应用。但是，对于机构或者研究组织来说，想完成大规模的图谱或者队列研究，单细胞的价格是十分昂贵的。获得一个低成本的解决方案，是非常重要的。

此外，一些结构微小的组织，如胚胎发育过程中的各个器官，消化后细胞总量少，单个样本无法达到上机细胞数量要求，而因各方面原因需要区别不同样本来源，传统的单细胞测序方案无法解决此问题。2021年cell发表了《Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution》一文，研究人员利用单细胞RNA测序和空间转录组学来表征随时间变化的肠道形态发生过程。该文给低起始量样本提供了新的解决方案。

今天我们给大家介绍一种Cell Hashing的技术。

解释Cell Hashing之前，大家不妨回忆一下CITE-seq这项技术，全称为cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing，该技术可以同时对细胞内RNA和细胞表面蛋白进行测序。基于此，Cell Hashing是在CITE-seq的基础上改进，不过它的应用不止于此，通过给通用的普适抗体加上HTO (A distinct Hashtag oligonucleotide) 标签，提前与样本细胞进行孵育，之后将不同样本的细胞进行混样测序。Cell Hashing实现了可以一次上机，完成多个样本的测序工作。

图1：Cell Hashing测序原理

效果评估

根据Marlon Stoeckius（Genome Biol. 2018 Dec 19;19(1):224）等人的研究发现，Cell Hashing可以根据HTO在不同样本间清晰的分出来，并且，对于多细胞这种情况也有很好的辨别作用。下图中可以清晰的看出HTO在不同样本的barcode中十分特异，虽然会存在少量的混杂情况，但是可以通过技术手段识别并且消除影响。

左图：Barcode中HTOA和HTOB的数量的散点图

右图：热图展示不同样本里标准化后的HTO值。

接下来，作者对数据进行了进一步分析，来评估准确性。作者通过TSNE降维后发现，八个混样样本被清晰的分出，但是也伴随着28个两两样本混合的类群。

通过对于样本去批次效应，以及亚群注释揭示了不同的免疫细胞群分布在不同的样本之间。其中包括了B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞等

作者介绍到这种多路复用策略不仅可以对多个供体进行混出，而且还可以同时分析多种实验条件。另外一个优势是在Barcode中可以根据单个HTO的清晰表达来区分单细胞和双细胞，同时也可以用来区分低质量的细胞和环境RNA，这种方法比通过对UMI进行阈值限定这种硬性方式更加的有效。

实测分析

在了解到销售同事的反馈有相关的老师需求之后，我们分析端同事进行了实际测试。

我们选择了二混一的样本数据进行分析（实际中可以选择更多样本混合）。基于新版的CellRanger 中的multi模块，我们成功的对样本进行了比对与定量工作，并且相较于常规的单细胞转录组，其还会额外生成一个barcode与HTO的矩阵。我们发现，在二混一的样本中，样本细胞得到了有效的鉴定与分离，且常规指标均满足分析需求。

图4.1:单细胞测序结果

图4.2:单细胞测序数据比对指标

并且我们基于这两个样本完成了细胞鉴定，发现细胞类型及占比符合该组织在之前单细胞文献中的报道。

图4.3：细胞比例占比图

图4.4：细胞比例TSNE图

总 结

对于有考虑在物种中做细胞图谱或者想做大队列研究的科研单位，使用多样本混合建库的方法可以保证数据的质量与结果的稳定性，也可以降低成本。