全流程覆盖！从DNA提取到数据分析，ABclonal FFPE DNA一体化解决方案化解NGS测序难...
导读
福尔马林固定石蜡包埋处理的样本（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE）因其可以室温长时间保存，易于运输等特点，已成为病理组织样本最常用的储存方式之一。目前，全球约有2~4亿的FFPE组织样本，是疾病诊断和科学研究最为宝贵的生物学资源之一。
随着下一代测序技术（NGS）的快速发展，FFPE样本除了用于组织形态观察外，更多的开始在分子层面进行研究。目前，大部分保存的肿瘤组织为FFPE样本，通过NGS技术对这些FFPE样本进行分子水平的研究，为建立新的肿瘤分类、诊断和预后标准，开发肿瘤早筛以及个体化医疗技术提供了有利依据。但由于福尔马林的固定容易使FFPE样本中的核酸发生不同程度的降解和分子间交联。此外，石蜡的高温渗透以及样本的长时间保存也会对样本中的核酸产生影响，导致从FFPE样本提取的DNA含量低、质量差。如何克服FFPE样本DNA提取和建库困难，充分挖掘FFPE中的有效核酸序列信息，已成为当前肿瘤研究领域亟待解决的问题。
ABclonal经过长时间的技术摸索和积累，开发了适用于FFPE样本的DNA提取、质量评估、文库构建、靶向捕获、数据分析等一系列产品和服务，可为客户提供一体化研究解决方案（图1）。
1.1 FFPE DNA提取
FFPE样本需要先进行脱蜡处理才能提取DNA，常用的脱蜡试剂是二甲苯，但二甲苯容易造成核酸片段化，且对人体有毒害作用。同时，FFPE样本中DNA分子与其它生物大分子（蛋白质、RNA）交联在一起，需要解除交联才能有效释放出DNA。ABclonal FFPE提取试剂盒（AFTSpin FFPE DNA Isolation Kit） 同时兼容二甲苯和无毒脱蜡液两种方法，可为实验人员提供更加安全的操作流程。同时，该试剂盒提供了优化的解交联步骤，能够高效释放DNA，释放出的DNA通过硅胶膜进行进一步分离纯化，从而获得高质量的DNA。
1.2 FFPE DNA质控
Nanodrop和Qubit是对DNA进行定量分析的两种常用方法。但Nanodrop能检测吸光度在260nm的所有物质（包括：DNA、RNA、蛋白质、降解核酸，游离核苷酸），因此不能准确定量有效DNA片段。Qubit虽然能够特异性检测双链DNA分子，但无法判断DNA分子的完整性，而因降解产生的小片段DNA（<100bp）分子对建库无实际意义。ABclonal FFPE DNA QC Kit能够对FFPE DNA进行更为准确、全面的质量评估。该试剂盒包含针对4个不同大小目的产物的特异性引物，根据多重PCR条带的数量进行分级，为后续建库时PCR循环数提供指导（图2）。
图2：ABclonal FFPE样本分级方案。PCR产物条带数目越多，代表样本质量越好，如PCR产物条带数目为4条，说明样本质量为最好的1级。
由于FFPE样本提取的DNA质量差，分析中会产生较多问题，例如reads 比对率低、高PCR Duplication rate、文库丰度低、高假阳性率等（表2）。针对这些问题，ABclonal可提供机械打断或酶切打断文库构建试剂盒。
表2. FFPE样本在测序中的常见问题。
2.1 机械打断建库
ABclonal机械打断DNA文库构建试剂盒（ Rapid Plus DNA Lib Prep Kit for Illumina V2）包含DNA损伤修复模块II（DDRE II），可提高成功率和文库产量，同时不增加测序的假阳性。DDRE II是多种酶按照一定的配方混合，经过优化和验证可修复切刻、缺口、碱基氧化、3'端损伤/封闭、无嘌呤嘧啶位点以及胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶等（表3）。
表3. DDRE Ⅱ可以修复的DNA损伤类型。
若FFPE DNA量较低或者损伤严重，用于建库的完整双链DNA（dsDNA）分子数很少，用常规的建库方式无法获得符合上机测序要求的文库量。ABclonal提供的单链DNA（ssDNA）建库技术（ Scale ssDNA-seq Lib Prep Kit for Illumina V2 、PCR Index Set_B/C），能以片段化的ssDNA作为模板进行文库构建，不受样本中完整dsDNA含量的限制，提高低质量样本文库构建成功率。
2.2 酶切打断建库
相比机械打断，酶切打断更温和，且不需要专门的仪器和耗材，降低了建库的门槛和成本。ABclonal酶切法DNA文库构建试剂盒（ FS DNA Lib Prep Kit V6 和 FS Pro DNA Lib Prep Kit for Illumina )将酶切打断、末端修复与加dA合并为一步，整个实验可在2 hr内完成。同时，ABclonal还提供单独的酶打断模块（DNA Frag Module），能够通过调整反应时间将DNA打断到不同大小的片段，打断后的DNA可搭配其它不同建库试剂盒进行文库构建。
2.3 建库接头
使用ExAmp扩增和Patterned flow cell样本槽的Illumina测序平台容易造成标签跳跃 (index hopping)的问题。Illumina白皮书中指出，使用Prepare dual indexed library with unique indexes是降低index hopping的最重要方法。ABclonal Unique Dual Index（with UMI）for Illumina是一种新型“3合1”接头，（图3）包含UMI，成组设计的P5 index 1 和P7 index 2，双端交叉检验，保证最终分析的reads最接近真实样本。这种接头可以降低实验操作引入的各种污染，剔除ExAmp测序平台造成的index hopping，支持大量样本同时上机测序，也可任意搭配建库试剂盒。
图3：ABclonal Unique Dual Index（with UMI）for Illumina接头结构及工作原理。
2.4 DNA磁珠
ABclonal DNA纯化磁珠（AFTMag NGS DNA Clean Beads）是基于SPRI（Solid Phase Reverse Immobilization）原理，使用精心优化的缓冲体系，可用于NGS文库构建过程中的DNA纯化与片段分选，兼容市场上主流的NGS文库构建试剂盒。结果与AMPure XP Beads高度一致，因此可以无缝替代AMPure XP Beads，有效降低建库成本。
ABclonal靶向捕获试剂可用于Illumina测序平台，包含杂交/洗脱液（Hybridization and Wash Kit），通用Blocker封闭试剂（ILM Universal Blockers-X1），磁珠（Streptavidin Beads）, 人基因组重复序列封闭试剂(Human Cot DNA)， 高保真低偏好性PCR试剂（Gloria Nova HS 2X PCR Mix for NGS）等。这些靶向捕获试剂经过精心优化，具有高灵敏性和特异性，可用于各种致病基因的研究以及健康筛查等。
高通量测序技术奠定了生信分析的“大数据”基础，面对如潮水般的基因序列数据，给后续基因组分析方法的研究和工具的发展带来了巨大挑战。ABclonal拥有强大的生信研发团队，不仅在“湿实验”完美助力客户，在生信环节亦可服务，帮助客户搭建成熟的生信分析平台。
关于ABclonal
武汉爱博泰克生物科技有限公司（ABclonal Technology Co.,Ltd.）成立于2011年，作为生命科学解决方案的提供商，旨在为更多的科研工作者、IVD企业、新技术开发企业提供抗体、酶、NGS产品和蛋白制品等全套解决方案。
ABclonal现有波士顿抗体与蛋白研发中心、上海诊断与科研分子酶产品研发基地以及中国武汉光谷诊断与科研免疫产品生产和研发基地。经过多年的深耕与发展，ABclonal已拥有免疫与分子酶两大技术平台，集新型分子酶、全领域应用NGS建库解决方案、新平台单克隆抗体与高活性蛋白制品的研发与生产于一体。ABclonal致力成为产业科研转化的核心企业，向生命科学研究工作者和应用企业提供全套可靠的技术解决方案。