如何构建与选择理想合理的小鼠疾病模型？
ALS小鼠疾病模型用于药物临床前评价研究转化效率低的经验教训，也让我们思考一个非常重要的问题，即如何构建与选择合理且理想的小鼠疾病模型，以提升其在药物研发研究中的临床转化价值与预测性。过去的失败经验已经告诉我们，如果选用了不适合或不准确的小鼠疾病模型，或小鼠体内实验设计不合理等，由此获得的临床前实验结果预测价值，则会大大降低。
让我们以ALS小鼠疾病模型研究相关实际案例，进行进一步深入的解析。回顾分析ALS小鼠疾病构建历程，即从起初的SOD1突变转基因小鼠，到后来新的TDP43突变小鼠疾病模型的发展过程。现在已经清楚，SOD1突变小鼠疾病模型并不能完全模拟人ALS疾病的所有特征，特别是缺乏该疾病诊断的典型特征，即SOD1患者大脑皮层运动神经元衰退与损失表型，显示了小鼠与人在运动皮层神经退行性病变方面的差异。还必须清楚一点的是，实际上，此类SOD1突变体转基因疾病模型的建立，需要依赖该突变基因较高水平的过表达，才能诱发ALS疾病发生。而且，野生型人SOD1基因过表达，也可以诱发小鼠相应的神经退行性改变。因此，有理由认为，过表达SOD1基因本身，足以诱发该疾病常见表型。
临床上有超过50%ALS患者，同时伴有额颞叶痴呆（FTLD），而SOD1突变小鼠则未见此表型。提示人与小鼠SOD1致病过程可能存在不同致病通路。所以，由该SOD1小鼠疾病模型研究获得的转化预测价值，也就可想而知了。另外，与其他ALS致病基因比较，SOD1基因本身，并不具备其独特ALS疾病表型，因此，在不同ALS疾病相关基因下游，有可能存在共享的致病通路。
PrP-TDP-43-A315T人突变小鼠是最早构建的TDP-43转基因小鼠模型，该转基因小鼠在3个月后，出现体重下降与行为相关等表型，并在153天左右开始死亡。起初的研究表明，约20%脊髓运动神经元损失，到约50%的皮层脊髓束轴突损失的发展过程。也有研究分别构建了人突变PrP-TDP-43-A315T和人野生型PrP-TDP-43转基因小鼠模型，且均有超过4倍表达量增加。这些TDP-43转基因小鼠都表现有存活时间缩短表型，且存活期长短与突变基因拷贝数负相关。而所有野生型TDP-43转基因小鼠，却未见早期死亡现象。
然而，值得注意的是，在仔细分析该研究后发现，其实研究中构建的两个过表达转基因小鼠模型（突变与野生型），TDP-43基因的表达量是有一定差异的，即野生TDP-43基因表达量较突变TDP-43基因表达略低，所以，以前研究中观察到TDP-43突变小鼠与野生型小鼠的某些表型差异现象，可能是因为转基因表达量差异所致。而且，如此的分析推论也得到另一个实验研究结果的间接证实，该研究分别通过比较突变TDP-43-M334V和野生型TDP-43两种转基因小鼠模型发现，两种小鼠（突变与野生型）基因表达量相似（均为～3倍增加），且未见两种小鼠在疾病发生严重程度方面有差异。提示TDP-43基因表达水平的改变，而不是基因突变特征本身，是诱发小鼠疾病表型的原因。并且，对TDP-43突变小鼠进一步分析研究也发现，该转基因小鼠死亡表型，并非由运动神经元功能损伤，导致运动神经元衰退变化，而是由胃肠道功能破坏所致。
由于转基因小鼠模型构建技术本身的特点，也使该类小鼠疾病模型研究结果的分析与解释，变得更为复杂。因为应用这种转基因小鼠研究中获得的研究结果，是很难将人TDP-43过表达与小鼠内源性tdp-43功能完全区分开来。而且，想要在人TDP-43转基因小鼠中，实现转基因过表达水平控制在接近ALS患者观察到表达水平，也是相当困难。实际上，有一些ALS患者不仅含有突变TDP-43蛋白，同时也见有另外ALS致病基因，比如C9ORF72基因突变同时出现的现象，而作为ALS致病基因C9ORF72，也可能引起运动神经元受损的特殊病理学改变。
ALS小鼠疾病模型构建策略与方法的不同，可直接影响到疾病基因拷贝数及表达量等，从而影响到疾病的表型特征与严重程度。比如，已知SOD1G93A转基因小鼠插入的人突变基因可高达25个拷贝数，表现有快速进行性运动神经元衰退的严重损伤，有研究表明，低拷贝数（～8-10拷贝数）的人SOD1G93A转基因小鼠品系，出现瘫痪症状时间约在24～34周鼠龄时候，明显晚于高拷贝数（～25拷贝数）转基因小鼠。如果突变和野生型SOD1转基因小鼠表达量相似，同样也有相似的神经学相关表型结果，说明小鼠疾病表型，包括早期轻度瘫痪迹象的脊髓空泡化，甚至运动神经元衰退损失等，可能不是因为突变基因引起，而更可能是因为基因的过表达所致。关于首个报道的ALS小鼠疾病模型，即SOD1G93A突变转基因小鼠模型，几乎都没有研究基因插入位点信息。幸运的是，到目前为止，还未见关于SOD1G93A转基因的随机插入，造成对已知基因破坏的报道。
因此，如何构建理想的突变转基因小鼠模型，实现转基因表达水平与小鼠内源性基因表达水平相似，以排除可能因为基因过表达本身引起的非特异性作用，目前的实际操作难度却相当大。因为转基因小鼠构建常常用到外源启动子，确保转基因在特定组织中高表达。而如此异位表达，又可能引起新的非特异性表型。比如，TDP-43A315T转基因小鼠是应用朊病毒启动子（Prp），虽然该启动子具有神经元强活性，但也广泛表达在其他组织细胞类型，可引起小鼠意外早期死亡，而死亡原因是由于肠道神经退行性病变，而非运动神经元损伤所致。
与随机转基因小鼠模型比较，基因定点插入小鼠模型，则具有病程进展较慢，且表型出现也较轻的特点，这可能与研究蛋白表达水平相对较低有关。但基因定点插入小鼠模型保留了基因正确时空表达水平，避免了一些蛋白因为过表达诱发的非特异性毒性作用，有助于在小鼠生命周期内，研究基因/蛋白与其作用靶标分子间的相互作机制。也有关于ALS小鼠疾病模型的基因定点插入的相关研究报道，比如，将含全人TDP-43 BAC（包括基因内含子和调控序列）插入小鼠Roas26位点，建立ALS小鼠疾病模型。该小鼠表现为人TDP-43低水平表达，只有轻度年龄依赖相关的运动功能障碍表型。另外，TDP-43Q331K突变定点插入小鼠模型，表现有TDP-43增加毒性功能, 即该基因出现剪切改变和蛋白自我调控功能障碍，导致额颞叶痴呆出现，虽然该小鼠模型并未表现包含体或者运动神经元损失表型。一般而言，这类定点插入的小鼠疾病模型，出现表型较慢也较轻，因而有利于揭示疾病症状出现的早期特征，有助于寻找早期生物标志物。当然，表型出现较晚，自然增加了相应研究成本。尽管如此，定点插入小鼠疾病模型，为研究疾病发生早期阶段，提供了充裕的研究窗口期。
相反, 转基因小鼠疾病模型，则常引起明显表型和显著运动神经元损失变化，使其成为疾病晚期过程相关研究的潜在选择。应用小鼠Prp启动子构建的TDP-43Q331转基因小鼠模型，不仅表现有运动神经元损失，也出现肌肉退行性改变和伴有运动损伤的神经肌肉结合损伤，但这些表型的出现，都与该基因过表达密切相关，呈现TDP-43表达的明显计量-效应依赖毒性作用。
如何定义好的小鼠疾病模型。首先，必须真正了解研究者感兴趣且需要的小鼠疾病模型，然后，才是寻找最为合适或更好的小鼠模型开展研究，并建议尽量选择不同策略及技术构建的小鼠疾病模型，开展疾病特征研究。比如，针对ALS小鼠疾病模型，需要了解研究目的是为了关注早期微小的脊髓运动神经元的变化？还是揭示上下神经元的损伤死亡？或者研究神经胶质细胞所发挥的作用等？
如何选择合适且理想的小鼠疾病模型。评价与选择是受诸多因素的影响。而关键考虑要素是小鼠疾病模型的设计策略，即小鼠疾病模型是如何设计与构建的，比如，是应用转基因随机过表达策略，还是定点/原位插入策略等。当然，研究者需要仔细分析研究小鼠疾病模型表型特征及其影响因素，期望能与对应人疾病表型特征及影响因素相似，比如，性别、年龄与遗传背景等，因为这些都是影响疾病表型特征的重要因素。总之，合适的小鼠疾病模型需要至少满足以下几点：
1. 能够准确模拟人相关基因特定功能与疾病特征，这是小鼠疾病模型应用于药物临床前评价研究最为重要的基石。
2. 有较高的研究结果出现频率，使其成为可靠科学研究的有力证据支持。
3. 可被重复验证，易被其他研究者使用，促进该研究领域发展进步。
4. 可被广泛应用，小鼠模型适合其他不同动物设施饲养与繁育等。
在选择小鼠疾病模型进行药物临床前研究的时候，建议参照如下步骤进行：
1. 确定研究疾病目的；
2. 了解影响疾病发生的内在与外在因素；
3. 查阅已有的相关小鼠模型综述文献；
4. 收集研究疾病的生物学信息资料；
5. 明确研究疾病的独特资源；
6. 确定小鼠疾病模型的初步选择；
7. 开展小鼠疾病模型初步研究；
8. 分析小鼠疾病模型研究初步结果与生物学信息资料等相关知识间的差距；
9. 评估小鼠疾病模型初步应用研究的有效性；10. 明确小鼠疾病模型的最终选择。