你不知道的10分lncRNA+免疫分析方案！
Identification of tumor immune infiltration-associated lncRNAs for improving prognosis and immunotherapy response of patients with non-small cell lung cancer鉴别肿瘤免疫浸润相关lncRNA对改善非小细胞肺癌患者预后及免疫治疗疗效的意义
一、研究背景
肺癌是最常见的肿瘤之一，而非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的一类，约占所有肺癌的85%，预后常较差。已有许多证据提示lncRNA在NSCLC的肿瘤微环境中起到一定调控作用，但肿瘤免疫浸润相关lncRNA与预后及免疫治疗疗效的关系仍有很大的研究空间。
二、研究流程
三、结果解析
1.lncRNA在人免疫细胞中的表达全景
在筛选基因构建模型之前，作者先对lncRNA在免疫细胞中的表达情况做了广泛的探索。为了提高研究的效率，作者首先将lncRNA表达量前5%的lncRNA纳入候选lncRNA集。在这些候选lncRNA中，作者分析得到91个在所有（共19种）免疫细胞类型中均高表达的lncRNA，117个仅在某一类免疫细胞中高表达的lncRNA。作者分别计算了这208个lncRNA的组织特异性指数（TSI）来评估lncRNA在免疫细胞中表达的特异程度，最终筛选得到了9个特异程度较高的lncRNA（仅在某一免疫细胞中表达，且TSI>0.5），其中3个为浆细胞样树突状细胞特异性（LOC101926943, AP003774.1, LINC00996）；3个为肥大细胞特异性（(LINC01234, TLR8-AS1, LINC01296）；2个为自然杀伤T细胞特异性（LINC00892, LINC00515）；1个为树突状细胞特异性（LINC00158）。
关于TSI的补充解释：
作者使用TSI评估lncRNA在免疫细胞中的表达特异性，其公式如下：
其中：N是免疫细胞类型的数量（本文中为19）xlnc,i是免疫细胞i中某一lncRNA标准化后的表达强度TSI值的范围是0-1，当lncRNA没有细胞特异性时TSI为0，随着lncRNA表达特异性的提高，TSI也不断接近1。
2.肿瘤免疫浸润相关lncRNA signature（TILSig）的建立
首先，作者筛选了在免疫细胞中广泛表达且TSI<0.2的57个免疫相关管家lncRNA（hklncRNA），并在其中进一步筛选得到了17个在免疫细胞系上调且在NSCLC细胞系中下调的肿瘤免疫浸润相关lncRNA（TILncRNA）。作者再对这17个TILncRNA在训练集GSE30219数据中进行了单变量Cox回归分析，发现其中有7个与患者总生存期（OS）显著相关。接下来，作者使用加权后的lncRNA表达量（权重由多因素Cox回归得到）构建了一个预后模型：
TILSig=(−0.1323×HCG26)+(−0.2323×PSMB8-AS1)+(0.0009×TNRC6C-AS1)+(0.2472×CARD8-AS1)+(0.1190×HCP5)+(−0.3019×LOC286437)+(−0.0572×LINC02256)
模型构建的简要流程如图1。
图1.TILSig的构建流程
作者将模型输出结果的中位数作为临界值，将训练集病人分为高风险组和低风险组，生存分析发现低风险组相比于高风险组有更长的OS（图2A），五年生存率也显著高于高风险组（60.4% vs. 37.9%）。
图2A.基于高低风险组的生存分析结果
作者将上述模型对患者生存情况的预测性能进行了ROC曲线分析，得到的对5年和3年OS预测的ROC曲线AUC值为0.665和0.646，说明模型在训练集中的预测性能较好（图2B）。图2C则概括性地展示了TILSig值的分布，患者生存情况以及对应的TILSig lncRNA表达情况。
图2B.使用TILSig预测5年和3年总生存期的ROC曲线
图2C.TILSig值的分布，患者生存情况以及对应的TILSig lncRNA表达情况
为进一步检验TILSig对免疫浸润情况的代表性，作者分别对高低风险组19种免疫细胞亚群进行了单样本基因集富集分析（ssGSEA），发现高低风险组之间的免疫浸润模式有显著差异——火山图显示低风险组病人有10个免疫细胞亚群富集，而高风险组仅有4个免疫细胞亚群富集（图2D）。上述结果提示高TILSig分数与更少的免疫细胞浸润和更差的预后相关。
图2D.肿瘤免疫细胞在高低风险组中的富集情况
3.TILSig的评估
为了评估TILSig的鲁棒性，作者使用独立的GSE31210数据集中226个病人的lncRNA表达和临床数据对模型进行评估。结果发现使用TILSig将病人进行分层之后可观测到OS和5年生存率的显著差异（图3A）。
图3A.基于GSE31210数据集使用TILSig将病人分层后进行的生存分析
因为测序平台的限制，来自另一独立的TCGA数据库数据集的979个数据中只包含TILSig中的4个TILncRNA表达数据，作者在未进行参数调整的情况下带入4个TILncRNA的表达数据计算了风险评分并划分了高低风险组，生存分析结果依然提示二者显著的总生存期和5年生存率差异（图3B）。
图3B.基于TCGA数据使用TILSig将病人分层后进行的生存分析
作者再进一步检验了TILSig评分在不同的免疫亚型中的分布情况，发现其在5个亚型中的分布存在显著差异（图3C），进一步分析发现，TILSig中的4个TILncRNA的表达情况也在5个亚型中有显著差异（图3D），结果提示TILSig与肿瘤免疫微环境存在密切相关。
图3C，D.TILSig评分及4个TILncRNA的表达情况在不同免疫亚型中的分布
另外，作者还尝试将模型应用于其它的癌种。在另外17种实体肿瘤基于TILSig评分进行分组后的单因素Cox回归分析中，作者发现结肠癌（COAD）和肾透明细胞癌（KIRC）数据的TILSig评分与OS存在相关。
为探究TILSig在预后预测中能否作为一个独立的因子，作者在经过年龄、性别、肿瘤分期等其它临床因子调整后的数据中进行了多变量Cox回归分析，发现高风险组相对于低风险组的HR值依然可以提示在两组间存在不同的预后（表2）。这样的结果说明TILSig在某种程度上可以作为一个独立的临床预后因子。
表2.不同数据集中对OS的单变量和多变量Cox回归分析
4.TILSig与肿瘤复发的相关性
作者使用无病生存期（DFS）作为衡量肿瘤复发情况的指标，在训练集GSE30219和测试集GSE31210中进行生存分析后发现高风险组的DFS较低风险组要差，5年无病生存率也更低（图4A，C），结果提示高风险组病人相对于低风险组肿瘤复发的概率要更高。
接下来，作者使用ROC曲线分析评估发现TILSig对肿瘤复发预测的性能优秀（训练集曲线AUC=0.607；测试集曲线AUC=0.618）。此外，作者还发现随着TILSig评分的升高，肿瘤复发的可能性也有随之升高的趋势。
图4A，C.训练集和测试集生存分析得到高低风险组的DFS；图4B，D.训练集和测试集TILSig对肿瘤复发预测的ROC曲线
作者还做了多变量Cox分析，证明基于TILSig评分划分的高低风险组与DFS存在独立于其它临床因子的相关性（表3）。
表3.在不同数据集中对DFS的单变量和多变量Cox回归分析
5.TILSig作为NSCLC患者免疫治疗疗效指标的潜力
先前的研究表明，免疫检查点抑制剂（ICI）相关基因（PD1，PD-L1，CTLA-4）可以对免疫浸润进行调节。为了研究免疫浸润与ICI相关基因之间的crosstalk，作者首先比较了ICI基因在高低风险组中的表达模式，发现高TILSig的病人倾向于更高的ICI基因表达（图5A，B，C）。结合前文中高TILSig对应不良预后的发现以及早前研究中报道的ICI相关基因的高表达与患者不良预后的关联，可以认为TILSig拥有一定的作为NSCLC患者免疫治疗疗效指标的潜力。
图5A，B，C.不同数据集中ICI相关基因在高低风险组中的表达情况
作者进一步研究发现，在低风险组的病人中可以观测到PD-L1和CTLA-4的表达与预后的关联，但在高风险组病人中，却没有观测到类似的关联（图5D，E，F）。此外，作者发现低风险组中低ICI相关基因表达的病人预后最好。这些结果也证明TILSig在一定程度上可以作为NSCLC患者免疫治疗疗效的指标。
图5D，E，F.基于不同风险评分以及ICI相关基因表达量的生存分析
在这里我们可以梳理一下作者的研究思路——首先分析了lncRNA在各种免疫细胞中的表达全景，证明其在不同的免疫细胞中有一定的差异，随后通过TSI分数，差异表达分析等手段筛选出了7个TILncRNA组成了一个风险评估模型。随后对模型的各项性能进行了评估，具体方式是使用模型输出值的中位数作为临界值将病人划分为高低风险组，然后在不同数据库中对比高低风险组病人的肿瘤免疫和预后差异，并分析了TILSig输出值与免疫细胞浸润，肿瘤复发以及免疫检查点抑制剂相关基因的关系，还对模型进行了ROC曲线分析，这些结果可以证明作者的模型在非小细胞肺癌患者预后及免疫治疗疗效方面拥有一定的预测性能。
小结
作者虽然在研究对象上选择了lncRNA，但使用的仍然是肿瘤免疫预后模型的套路——通过差异表达分析等手段筛选出signature建立模型，并探索基于模型评分值分组的病人在临床、预后等方面的差异，以及模型评分值与肿瘤浸润免疫细胞和免疫治疗靶点基因的关联，证明模型的使用价值。这启示我们，同一种套路可以应用于多种不同的分子，在某个方向的研究遇到瓶颈时，不妨试试换种分子，或许能有突破。