『珍藏版』Nature综述 | 纤维化：从发生机制到药物研发
纤维化（Fibrosis）不是疾病，而是多种类型组织损伤尤其是在慢性炎症性疾病过程中，组织修复反应失调的结局。它可以影响任何器官，以至于在工业化世界中，因纤维化引起的死亡人数占总死亡人数比例的45%。长期以来，人们一直认为纤维化不可逆，但临床前模型和临床试验均表明，它是一个高度动态变化的过程。当组织受到损伤时，会发生局部成纤维细胞的激活，炎性介质的分泌以及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）（例如胶原蛋白和纤连蛋白）的合成，这些变化共同启动愈伤反应。然而，当损伤是严重性或反复发作时，ECM成分会持续累积进而导致组织结构破坏，器官功能障碍甚至衰竭。
值得注意的是，对胚胎的组织修复研究表明，在伤口出现炎症反应之前，未成熟的组织能够无疤痕愈合，提示炎症可能是引起纤维化的原因。从遗传学角度来看，与纤维化相关的特定突变和罕见变体，包括肺纤维化的MUC5B，心脏纤维化的MYH7和杜氏肌营养不良相关骨骼肌纤维化的DMD揭示出抗纤维化靶标以及可用药物治疗的核心通路。此类遗传学改变表明，非成纤维细胞类型参与了间充质细胞激活的上游，强调多细胞相互作用在纤维化发病机理中的重要性。然而，尽管我们对纤维化的病理学和分子生物学认知已有长足进步，但在确定假定的抗纤维化靶点以及将这种认识转化为有效治疗之间仍存在鸿沟。
近日，来自美国辉瑞公司全球研究中心的Thomas A. Wynn团队在Nature杂志上发表了一篇题为 Fibrosis: from mechanisms to medicines 的综述，在这篇文章中，作者详细阐述了纤维化关键分子机制的最新研究进展，并讨论了如何将这些信息转化为抗纤维化治疗的开发策略。
纤维化的单细胞基因组学
单细胞多组学方法正在改变我们对疾病发病机理的理解，这项“分辨率革命”使得在单细胞水平上无偏见地对细胞状态和类型探索成为可能，且已被纤维化研究界广泛采用，从而加深对驱动各器官纤维化的复杂多细胞相互作用的理解。举例而言，一项针对32例特发性肺纤维化（IPF）患者，18例慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者和29位健康对照个体的312928个肺细胞的研究，鉴定出位于成肌纤维细胞灶边缘的异常嗜碱性上皮细胞群富含于IPF患者的肺部。除了对肺纤维化的单细胞研究之外，对超过100000个人类肝细胞进行分析，鉴定出与瘢痕相关的一组巨噬细胞亚群，这些巨噬细胞表达TREM2和CD9，由循环单核细胞分化并具有促纤维化作用，且已证明在肝纤维化中扩张；此外，还定义一群内皮细胞亚群，它们表达与疾病相关的非典型趋化因子受体1（atypical chemokine receptor-1, ACKR1）和质膜囊泡相关蛋白（plasmalemma vesicle-associated protein, PLVAP），且在分布上局限于纤维变性微环境并能增强白细胞的迁移。此外，作者在文章的这一部分也详细阐明了scRNA-seq在结肠炎，关节炎以及肾脏损伤和纤维化方面的研究进展。
成纤维细胞的异质性和可塑性
2.1功能性成纤维细胞的异质性
在器官纤维化过程中，成纤维细胞群内部存在明显功能异质性。一项命运映射和实时成像的结合实验表明，筋膜成纤维细胞（fascia fibroblasts）作为成纤维细胞的一个特殊子集，在皮肤受损时可以上升至皮肤表面，如若在皮肤下放置不可渗透膜以阻止筋膜成纤维细胞向表面迁移则会导致慢性开放性伤口出现。
年龄增长被认为是成纤维细胞功能异质性的驱动因素，老年鼠的伤口愈合速度各不相同，scRNA-seq在慢速与快速愈合的老年鼠伤口中鉴定出具有不同细胞因子表达谱的成纤维细胞的不同亚群。这提示伴随年龄增长，伤口愈合的可变性增加可能反映了个体之间随机的衰老轨迹，这在为老年人群设计个性化抗纤维化疗法时需要加以考虑。
2.2 成纤维细胞可塑性
值得注意的是，所有具有异质性的成纤维细胞能够在纤维化的进展和消退过程中表现出明显的可塑性和表型转换。例如，转录因子PU.1（也称为SPI1）在成纤维细胞极化和纤维生成中发挥主要作用。PU.1既能使静止的成纤维细胞极化，又能使降解ECM的炎性成纤维细胞重新极化为产生ECM的纤维化表型。此外，PU.1的失活使纤维化的成纤维细胞重新编程为静止的成纤维细胞，从而导致纤维化的消退。在纤维化过程中，成肌纤维细胞与其他细胞类型之间也具有显着的谱系间可塑性。在小鼠皮肤伤口愈合期间，脂肪细胞可以从成肌纤维细胞再生，而这种重新编程需要新生毛囊，会触发骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号传导以及在发育过程中表达的脂肪细胞转录因子的激活。
上述研究共同强调了成纤维细胞在器官内部和器官之间的多样性，功能异质性和可塑性。在不同疾病背景下精确地描述成纤维细胞有助于合理且高度靶向的设计抗纤维化疗法，对病理性成纤维细胞亚群进行特异性抑制，消融或重编程，同时保留基本的稳态成纤维细胞功能。
图1. 成纤维细胞的异质性和可塑性
间充质细胞的代谢调控
显而易见的是，参与纤维化进展和消退的细胞在组织修复过程中被重编程以执行不同的功能。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）驱动的纤维化背景下，肝脂质代谢失调是肝损伤和肝硬化的关键驱动因素，局部组织间充质细胞的代谢改变可能会提供未来的治疗途径，包括主要的碳水化合物、氨基酸和脂质代谢途径。
在组织损伤后，间充质细胞会发生显著代谢变化，以促进耗能细胞功能包括增殖和蛋白质合成等。成纤维细胞的活化会增加糖酵解酶，如己糖激酶2和乳酸脱氢酶，进而促进细胞增殖和胶原合成。而在增强的糖酵解过程中，进入柠檬酸循环之前，线粒体基质中增加的丙酮酸转化为乙酰辅酶A，这会产生中间代谢物，例如琥珀酸盐，同样可促进纤维化发生。在纤维化过程中，间质细胞还可通过谷氨酰胺水解重编程利用氨基酸代谢的变化。在TGFβ1刺激的成纤维细胞中，谷氨酰胺分解和关键酶谷氨酰胺酶的水平增加，这导致谷氨酰胺向谷氨酸的转化增强，赋予对细胞凋亡的抗性，并通过mTOR信号传导促进了胶原蛋白的稳定化。已有研究证明在体内，通过抑制谷氨酰胺酶1可改善博来霉素和TGFβ1诱导的肺纤维化。此外，脂肪酸氧化的变化也与纤维发生有关。在小鼠和人类的肾小管间质纤维化中，细胞内脂肪酸氧化被下调，并且其水平恢复可组织纤维化发生。据报道，糖酵解过程被上调以补偿肾损伤期间减少的脂肪酸氧化，这可能会导致增强的纤维化进展。
关键的代谢途径，例如糖酵解增加，谷氨酰胺分解上调和脂肪酸氧化增强，可能成为成纤维细胞活化的重要驱动力。靶向这些代谢途径的药物尚未作为抗纤维化疗法进入临床。然而，具有已知安全性，靶向代谢途径的药物已被批准或正在用于治疗癌症的临床试验，这增加了人们对它们将来也可以用于治疗纤维化疾病的希望。
巨噬细胞介导的纤维化调节
炎性单核细胞和组织巨噬细胞是纤维化的关键调节剂，在组织损伤的发生，维持和缓解中发挥重要作用。此外，单核细胞和巨噬细胞可经历显着的功能可塑性，在伤口愈合过程中表现出不同的表型，当然这取决于多种线索，包括微环境，组织损伤及修复的时间阶段等。组织巨噬细胞也是负责募集T细胞和成纤维细胞的趋化因子的重要生产者，以协调纤维化微环境的发育。
4.1单核细胞和巨噬细胞的功能异质性
目前已有几项研究鉴定出可以调节纤维化和组织重塑的单核细胞亚群。例如，以癌胚抗原相关粘附分子-1（CEACAM1 MSR1 LY6C-F4/80-MAC1 单核细胞）为特征的非典型单核细胞群，且已被称为“SatMs（segregated-nucleus-containing atypical monocytes）”，在肺纤维化中起关键作用。目前已确定在肺，脂肪，心脏和真皮上保守的两个独立的间质巨噬细胞亚群：LYVE1loMHCIIhiCX3CR1hi（LYVE1loMHCIIhi）和LYVE1hiMHCIIloCX3CR1lo（LYVE1hiMHCIIlo）单核细胞衍生的间质巨噬细胞。在诱导型巨噬细胞耗竭的小鼠模型中，LYVE1hiMHCIIlo间质巨噬细胞的缺失加剧了实验性肺纤维化，从而表明两个独立的间质巨噬细胞群体在整个组织中共存，且具有保守的微环境依赖性功能程序。
对单核细胞和巨噬细胞在组织损伤和修复过程中的调节作用的研究主要集中在血液来源的单核细胞和巨噬细胞上。然而，越来越多的证据表明，常驻腔巨噬细胞也是纤维化和组织重塑的关键因素。例如，响应于无菌肝损伤，成熟的F4/80hiGATA6 腹膜腔巨噬细胞储库可通过跨间皮直接（无血管）募集而迅速侵入肝脏，这些募集的巨噬细胞可分解坏死细胞核，释放DNA并在损伤部位形成覆盖物。同样，在小鼠心肌梗塞后，小鼠心包液中的GATA6 巨噬细胞会侵袭心外膜并失去GATA6表达，但仍具有抗纤维化特性，这种巨噬细胞群体的丧失会增强缺血性损伤后的间质纤维化。在人的心包液中也发现了GATA6 巨噬细胞，提示这种对心包组织区室的免疫心脏保护作用可能与人的类似疾病相关。
4.2巨噬细胞与成纤维细胞的串扰
无论单核细胞和巨噬细胞如何募集到组织损伤区域，纤维化前巨噬细胞通常通过与成纤维细胞的一系列相互作用来协调瘢痕形成，这是纤维化过程中病理性ECM沉积的主要细胞来源。举例而言，最近已显示巨噬细胞衍生的双调蛋白通过整合素-αV介导的TGFβ的活化诱导间充质基质细胞分化为成肌纤维细胞。先前的研究表明，“邻近性”对于使巨噬细胞和收缩性成纤维细胞之间的相互影响至关重要。然而，截至目前仍不清楚这两种细胞类型之间如何建立“邻近性”。一项研究表明，收缩的成纤维细胞在原纤维胶原蛋白基质中产生形变场，从而为巨噬细胞提供物理线索，可以从数百微米的距离向力源迁移，并且在基质内存在动态力源是启动和引导巨噬细胞迁移所必需的。值得注意的是，与传统的关于巨噬细胞如何在纤维化组织内迁移的观点相反，这项研究的作者提出巨噬细胞机械感知其底物的局部移位速度，从而使收缩性成纤维细胞在超过趋化梯度范围的距离上吸引巨噬细胞。
整合素介导的TGFβ活化
细胞周围纤维化基质是一个非常动态的环境，许多关键细胞间和细胞及基质间相互作用是由整合素家族的成员介导。重要的是，整合素可以将空间固定的细胞外信号转变为多种细胞行为改变，包括细胞粘附，迁移，增殖，分化和凋亡的改变。此外，整合素还可以增强来自可溶性促纤维化生长因子（例如TGFβ1）的信号。TGFβ是主要的促纤维化细胞因子，因此可能作为潜在的抗纤维化靶标。然而，持续的全身性抑制TGFβ1具有强烈副作用，例如TGFβ1敲除小鼠会发展为系统性自身免疫。因此，为避免有害作用，可能需要选择正确的抑制作用强度或持续时间，共同给药抗炎疗法或通过阻断整合素和其他局部激活潜在TGFβ1的介质来抑制组织中特定部位的TGFβ1。
基于大量临床前数据，靶向整合素仍然是纤维化领域非常活跃的研究方向，在临床试验中正在评估多种基于小分子和抗体的方法，包括旨在同时选择性靶向多种含αv的整合素的抑制剂。这包括在肺纤维化中涉及肺纤维化的αvβ6（NCT01371305），αvβ1和αvβ6（NCT04072315）以及αvβ1，αvβ3和αvβ6（NCT03949530）抑制剂的2期试验。在这些试验中，患者安全性将是重要的考虑因素，且出于安全考虑，Biogen最近终止了对IPF患者的选择性抗αvβ6抗体的试验。
细胞因子介导的纤维化调节
除了TGFβ以外，其他多种细胞因子也被认为是纤维化的诱因。例如，IL-17A可以诱导不同器官系统的纤维化，包括肺、肝、肾、心脏和皮肤。在博来霉素诱导的肺纤维化的研究中，γδ和CD4 T细胞产生的IL-17A引起肺部炎症，中性粒细胞募集和TGFβ1的产生。对缺乏IL-17A或其受体IL-17RA的小鼠进行的实验以及使用IL-17A中和抗体进行的治疗性研究证实，IL-17A信号传导参与多个组织的纤维化等。Caspase 1，NOD，LRR以及NFκB也被确定为IL-17A–TGFβ轴的重要上游激活剂。一项相关研究表明，NLRP3炎性小体的持续活化与趋化因子表达增加，嗜中性粒细胞和巨噬细胞募集以及IL-17A和TNF131持续产生有关。总的来说，促纤维化TGFβ信号传导途径的激活是由几种协作机制驱动的，而其中IL-17A具有重要作用。此外，尽管IL-13可以诱导并激活巨噬细胞中的TGFβ，但它也可以部分地直接靶向基质和实质细胞，包括上皮细胞群和产生胶原的成纤维细胞，从而独立于TGFβ促进纤维化。缺乏IL-13，IL-4R或IL-13Rβ1的小鼠，以及用抗IL-13或IL-4R的中和抗体治疗的动物，在多种类型的组织损伤后纤维化减少，证实了2型细胞因子信号传导在纤维化进程中至关重要。
鉴于可靠的临床前数据，目前已经在2期试验中测试了用于肺纤维化，皮肤瘢痕和全身性硬化症的单独IL-13抑制剂或IL-4和IL-13抑制剂组合。尽管迄今为止的结果大多是阴性或混合的，但在弥漫性皮肤系统性硬化的24周研究中，针对IL-4和IL-13的双特异性抗体Romilkimab（SAR156597）确实对改良的Rodnan皮肤评分有显着影响。
图2. 不同的细胞因子途径驱动纤维化发生
微生物组对纤维化的贡献
肠道微生物种群对于维持肠道健康而言至关重要，然而当健康微生物和致病微生物之间的平衡朝着致病性亚群转移时，疾病就会随之而来。其中，微生物共济失调被认为是炎症性肠病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的发病机理的关键驱动力，并有证据表明微生物群与纤维化的发展之间存在密切的联系。举例而言，患有克罗恩氏病的患者携带NOD2基因变体，以致狭窄形成的风险增加，而狭窄是肠道纤维化的主要表现。此外，在沙门氏菌诱导结肠炎的小鼠模型中，细菌信号转接头分子MyD88的整体缺失减少了肠道纤维化。微生物群驱动的肠纤维化可通过上皮细胞上IL-33受体ST2的诱导或TL1A的促纤维化作用来介导。
由于肠屏障的破坏，细菌及其产物通过肠屏障的转运在慢性肝病患者中很常见。通过使用抗生素以减少微生物负荷来阻断小鼠中的TLR4信号传导且降低肝脏对肠道微生物的暴露，可改善实验性肝纤维化发生。部分肠道菌群可能在肝纤维化中具有保肝作用，例如，无菌小鼠的肝脏中ECM沉积更高，MyD88和TRIF缺陷小鼠也表现出相同的结果。值得注意的是，TLR4与炎症的病理生理相关性已导致TLR4抑制剂用于治疗类风湿关节炎的临床试验（NCT03241108）。
发现与人类纤维化疾病高度相关的关键治疗靶标以及开发有效抗纤维化治疗方法仍然是研究的重点。单细胞多组学技术等新兴技术的发展，正在以前所未有的分辨率和效率解码纤维化的细胞和分子机制。然而，尽管在过去几年中对纤维化发病机理的理解已经取得令人瞩目的进展，但仍需要克服多个挑战才能将这些信息转化为有效的抗纤维化疗法：（1）需要开发预后动物模型和离体原代人体组织培养系统，以更好地将新机制从实验室进行临床转化；（2）患者异质性以及纤维化进程缓慢的事实，使临床试验的患者选择变得困难。因此，需要准确有效的鉴定出纤维化疾病进展预测因子，以将患者分型再将其纳入试验。
与癌症以及病毒性肝炎等领域所取得的重大进展相似，由于纤维化日益被认为是一种高度复杂的疾病，因此未来可能会看到越来越多的临床试验测试组合药物来治疗纤维化，这些抗纤维化药物组合可能会针对多种正交机制，包括一系列受体，信号传导途径和已经显示出在多种疾病状态下充当纤维化核心驱动力的细胞类型，那么有效的抗纤维化疗法的出现将指日可待。