大规模分离收获外泌体新技术,满足临床用量需求

外泌体(Exosomes)是活细胞分泌的,大小为30-200nm,密度为1.13-1.18g/mL的磷脂双分子层结构囊泡状小体,在电镜下呈现茶托状结构。

外泌体是由核内体系统形成的,主要经历3个阶段:首先,细胞质膜初次内陷形成内吞小体,多个内吞小体相互融合形成早期核内体;其次,早期核内体再次内陷包裹细胞内物质,形成多个腔内小囊泡,进一步转变成晚期核内体,即多泡体;最后,多泡体与细胞质膜融合,释放腔内小囊泡到细胞外空间,即外泌体[1]。Exo Carta数据库显示外泌体中含有41860种蛋白质、1116种脂质、3408种mRNA及2838种miRNA,通过与靶细胞融合释放其内的活性成分发挥作用,在细胞与细胞之间的信息交流中发挥着重要作用,同时也参与多种疾病的发生与发展。

▲图1:细胞外囊泡分泌原理(图片来源:网络)

目前,外泌体已逐渐用于包括心血管疾病、中枢神经系统疾病、癌症、肝损伤、肺损伤及肾损伤等疾病的诊断。另一方面,外泌体,尤其是干细胞外泌体,携带的大量生物活性物质,可代替干细胞发挥修复治疗多种重要器官及组织损伤的功能。而且外泌体的应用避免了细胞直接移植存在的多种潜在风险,且免疫原性低又便于保存和运输,作为“无细胞的细胞治疗技术”显示出独特的优势。

另外,由于外泌体的生物相容性与生物降解性,以及较低的毒性和较好的组织耐受性,外泌体也被认为是非常有应用前景的药物载体。

▲图2:外泌体的应用前景

外泌体不论是自身用于疾病治疗,还是做为药物载体递送平台,需求量均非常大,我们简要列出了外泌体临床前(表1)及临床研究(表2)中的剂量与给药策略[2],可见大规模分离生产外泌体是外泌体临床转化的重要前提之一。

表1

使用基于外泌体的疗法临床前研究给药策略总结

Myocardial infarction (M.I); Intravenous (I.V); Intraperitoneal (I.P); Intracerebral ventricular (I.C.V); mouse bone marrow (mBM)

表2

使用外泌体作为治疗干预的临床试验总结

外泌体分离纯化方法的优劣势

然而,目前针对外泌体的分离纯化方法还没有统一的标准,严重制约着外泌体相关的基础研究及临床应用。

差速超速离心法是最常用的方法,被视为外泌体提取的“金标准”,但需要配备超速离心机,且操作复杂,耗时久,产量低,难以处理大批量样本;

密度梯度离心法也可实现外泌体的分离,但存在与差速超速离心法相似的问题;

免疫亲和法可分离表达特定蛋白质的外泌体,纯度较高,但该方法成本过高,也不适用于大量样本中外泌体的分离;

聚合物沉淀法可处理大体积的样本,但纯度较低,且聚合物材料的混杂可能会影响下游分析;

尺寸排阻色谱法简便、经济、回收率高,可处理中等体积样本,但不能分离与外泌体尺寸相近的颗粒,且经尺寸排阻色谱后的外泌体会被严重稀释,需要将其浓缩才能用于后续实验;

切向流超滤法成本低,实验重现性好,且富集效率高而不易形成聚集体,不影响外泌体的生物活性,更利于从大体积样本(如细胞培养上清、尿液)中分离外泌体,但纯度略低;

微流控法处理速度快、成本低,但只适合少量样本的提取。

上述分离方法在操作性、处理量、纯度及成本等方面各有优缺点,因此,急需开发一种强大且可扩展的方法用于大样本外泌体的分离。

3D FloTrix® vivaEXO  

外泌体收获系统

此外泌体收获装置,是一款用于外泌体提纯的多级分离装置,可处理1-10L细胞上清,10L培养上清液处理完成仅需3小时左右。整体仪器按照现代医药卫生要求设计,设备主机和一次性耗材包符合卫生级制药要求,参数实时检测及控制准确,控制系统操作简单、合理。

▲图3:3D FloTrix® vivaEXO  外泌体收获系统

产品特点:

1、处理量大,可从大体积样品(如细胞培养上清)中分离获得高浓度的外泌体;

2、耗时短,处理10L的细胞上清仅需3小时左右;

3、一体化集成,操作简单明了;

4、vivaEXO装置可与华龛生物vivaSPIN系列生物反应器连接,MSCs大规模培养后获得的细胞上清直接进入vivaEXO装置,一键分离外泌体;

5、所有分离柱均可定制,用于不同颗粒状物质(如微囊泡)分离。

客户案例

我们使用vivaEXO分离获得外泌体,并与超速离心法对比(客户案例)。

通过vivaEXO设备,1L细胞上清可获取外泌体颗粒数6.67×1012,平均粒径为102.5 nm;与之对比,通过超速离心法, 1L细胞上清可获取外泌体颗粒数8.9×1010,平均粒径为159.5nm。可见,采用vivaEXO获取的外泌体浓度较高,而且粒径更小。

图4  vivaEXO(左)与超速离心法(右)分离的外泌体粒径及

浓度示意图比较

另外,两种方法均可见外泌体的经典结构。

图5  vivaEXO(左)与超速离心法(右)分离的外泌体结构比较

外泌体western blot检测

图6  vivaEXO分离的外泌体CD63与TSG101蛋白表达

结论

使用vivaEXO外泌体分离装置获得的外泌体结构清楚,粒径较小,浓度较高。另外,本装置中所使用的分离柱均可以定制,用于其它物质的分离。

其它应用

1、 微囊泡分离;

2、 蛋白分离;

3、 病毒分离。

Ending

参考文献:

[1] Record M, Silvente-Poirot S, Poirot M, et al. Extracellular vesicles: lipids as key components of their biogenesis and functions [J]. J Lipid Res, 2018, 59(8):1316-1324.

[2] Gupta D, Maria Zickler A, El Andaloussi S. Dosing extracellular vesicles [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2021, 178: 113961.

(0)

相关推荐

  • NK细胞外泌体的抗肿瘤作用

    在癌症研究中,以前的研究多数是探索癌细胞释放的外泌体,但很少了解正常细胞释放的外泌体的功能.自然杀伤(NK)细胞对转移性或血液恶性肿瘤具有快速免疫作用,临床上已经在开发NK细胞的抗肿瘤特性.然而,NK ...

  • 粉煤灰制备白炭黑方法汇总

    粉煤灰 粉煤灰制备白炭黑方法多,某公司粉煤灰经超细磨粉机后经不同方法提取白炭黑研究进展大,现汇总如下.另外,桂林鸿程是所生产粉煤灰磨粉机可将粉煤灰磨细到3微米左右,咨询请联系. 粉煤灰制备白炭黑,粉煤 ...

  • 温州医科大学 Nature Method:通过超快速分离系统(EXODUS)检测外泌体

    基于液体活检的诊断策略是临床诊断技术的重要发展方向,全球市场对相关技术具有迫切需求.外泌体广泛存在于各种体液中,是十分理想的液体活检材料,也是近些年液体活检研究研发的重点领域.但是,目前如何快速高效精 ...

  • JEV:实验评估表明超速离心分离囊泡纯度最高

    分析六种细胞外囊泡分离方法的质量和效率 细胞外囊泡(EVs)是细胞间通讯的重要载体,细胞外囊泡的研究具有重要的基础和临床意义.这一点被越来越多的研究者所认可.这些年随着囊泡领域的突飞猛进,多种不同分离 ...

  • qEV高纯度外泌体尺寸排阻SEC分离柱

    qEV是一种根据尺寸排阻原理SEC(Size exclusion Chromatography)设计的细胞外囊泡(外泌体)分离-纯化技术,由新西兰Izon公司研发和生产.qEV可以从细胞培养上清液或复 ...

  • (物理法)绿捷锂电池回收设备物理法干式工艺技术

    绿捷锂电池回收设备物理法干式工艺技术钜大LARGE  |  点击量:364次  |  2019年04月01日一.目的:近年来,废弃锂离子电池的负极处理己经成为热点环境问题.回收锂离子电池中的有价金属. ...

  • 原代细胞分离实验技术服务

    凡是来源于胚胎.组织器官及外周血,经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞.人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,必须将现有的组织块充分散开, ...

  • 基于声流体分离唾液外泌体的液体活检技术有望在早期检测口咽癌

    口腔后部和咽喉上部的癌症通常只能在晚期被发现,部分原因是由于这些位置隐蔽,在常规临床检查中难以看见. Elsevier出版集团旗下的<Journal of Molecular Diagnosti ...

  • 专题 | Cell重磅文章加速外泌体生物标志物临床应用(下)

    基本信息 题目:Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Defifine Multiple Human Cancers 期刊:Cell 影响因子:3 ...

  • 【关注】靶向KRAS G12D突变的胰腺癌外泌体治疗即将进入临床阶段| Codiak最新动态

    自20世纪80年代初在癌症中首次发现突变基因以来,研究人员一直在寻找靶向KRAS突变的方法.现在,随着制药公司争相将第一种靶向突变KRAS蛋白的药物带给癌症患者,MD安德森癌症中心的一位科学家正在尝试 ...

  • 新技术丨一种血浆外泌体及相关标志物的快速分离鉴定方法

    循环中的外泌体是癌症相关RNA和蛋白质生物标志物的主要来源,将有助于癌症的早期检测.液体活检以及即时诊断应用.不幸的是,由于外泌体体积小(50-150nm)密度低,所以非常难以从血浆中分离和纯化出来外 ...

  • Norgen尿液外泌体提取试剂盒快速分离,真神奇

    如何提取各种样本类型中的外泌体呢?Norgen血浆/血清外泌体提取试剂盒,使用血浆/血清外泌体提取试剂盒从1 mL和10 mL血浆中纯化的完整外泌体,使用NanoSight®LM10仪器观察如下图: ...

  • EV-TRACK: 外泌体分离及鉴定数据库

    导语 细胞外囊泡(EVs)具有重要的(病理)生理作用,因此在过去的十年中它们一直是研究的重点.从不同细胞类型(甚至从单个细胞类型)释放的细胞外囊泡在大小,蛋白质,核酸和脂质含量方面均不相同.EV种群的 ...

  • 外泌体-分离细胞外囊泡(EVs)的分离技术

    不同的生物物理和生物化学性质可用于分离EV,包括大小.质量密度.形状.电荷和抗原表位.最常见的EVs分离方法的原理如下图所示.下表提供了这些方法的比较,包括每种方法的优点和局限性.有分离方法都会影响E ...

  • 外泌体的三种分离方法

    Exosome (外泌体)是来源于膜的纳米级囊泡,直径在30至150 nm ,它们是在正常和病理条件下由许多类型的细胞释放的.exosome对细胞功能的影响已经与各种生理过程相关联,包括: 细胞间通讯 ...