平台小知识vol.2：荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization）简称FISH。这是一个形态与分子相结合的检测平台，在基础病理与分子病理检测中都是能手。话不多说，先上张好看的图！
*miR-133(green) and myogenin mRNA (red) in C2C12differentiating cells
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什么是荧光原位杂交技术？
原理：原位杂交是在组织、细胞或染色体等水平对DNA或RNA进行定性、定位或定量分析的实验技术，荧光原位杂交则是使用了荧光标记的探针特异性地与目标序列杂交，分为DNA-FISH和RNA-FISH，以DNA-FISH为例，下图显示了关键的杂交变性过程。
技术
仪器/
可视化方法
主要优势
DNA-FISH
荧光显微法
多重复用：在同一样本中直观显示多个靶标
基因存在、拷贝数和位置；突变分析
RNA-FISH
荧光显微法、HCS和流式细胞分析
多重复用：在同一样本中直观显示多个靶标
基因表达、RNA的时间和空间定位
*DNA-FISH与RNA-FISH的特点比较
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以临床常用的DNA-FISH为例，咱们记几句入门口诀：
❶ FISH检测的是DNA，不是蛋白质，所以它和免疫组化是不一样的；
❷ FISH是在标本原位上直接检测DNA，这些DNA不用提纯，所以他和PCR是不一样的；
❸ FISH检测可在间期细胞上进行，有别于核型分析；
❹ FISH探针种类很多，不是说一种探针可以检测所有的肿瘤基因检测项目；
❺ FISH需要检测的是一段相对较长的DNA片段（至少100kb），所以简单的突变（只有1个或者几个碱基改变或者缺失）不能用FISH检测；
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FISH仪器中最主要（最昂贵的）的是分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件）和荧光原位杂交仪。
*荧光原位杂交仪
*荧光显微系统
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关键物质
从FISH的原理就可以看出，它所采用的荧光标记的探针，是其技术的核心，这次我们主要讲一下荧光标记的DNA探针，也是目前医学上最广泛使用的。
FISH探针的主要分类和用途：
着丝粒探针（CSP探针）：用于检测染色体数目异常如三体、单体等。
染色体臂或整条染色体涂染探针（WPP探针）：用于检测染色体易位和标记染色体。
序列特异性探针（GLP探针）：包括臂、带和基因探针等多种，
用于检测基因缺失和重排。
除此之外，常用的还有亚端粒探针，靠近端粒的200-300Kb为染色体特异性DNA，用于检测涉及端粒的隐匿性易位。
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相关应用
在讲应用之前，先来夸一下FISH平台，FISH技术有以下几点优势：安全、快速、灵敏度高；探针能较长时间保存；多色标记，简单直观；可用于中期染色体及间期细胞的分析；可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。
近几年已有100种肿瘤基因FISH探针用于临床，因此，在分子检测平台中地位越发重要。首先来看一下可用FISH技术检测的基因异常形式，包括基因扩增、基因断裂、基因缺失和基因融合。“金标准”是检测平台都很希望被冠上的荣誉称号，FISH技术当仁不让，它是某些基因异常检测的“金标准”，如乳腺癌的HER-2基因检测，肺癌的ALK基因检测等。
（一）“金标准”之HER2基因检测
一般采用DNA染料SYBR® Green I，染料能够与双链结合，发出荧光，它自身也会发出微弱的荧光，应用体系内所有荧光的信号强度与DNA量成正比，所以它对模板没有选择性，且不需要设计复杂的探针，经济实惠。但是也因此暴露缺陷，染料能与所有双链DNA结合，导致非特异性扩增和引物二聚体也会被检测出，并干扰结果。有缺陷就有补救的方法，溶解曲线的分析能帮助操作者判断产物的特异性，溶解曲线是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。单一峰的溶解曲线说明扩增特异性好，有双峰代表出现了非特异扩增或引物二聚体。
一般而言，乳腺癌患者首选做免疫组化，免疫组化2+的患者，仍然存在23.3%的患者HER2基因扩增，而此类人群亦能受益于赫赛汀（曲妥珠单抗）等靶向药物，必须要再做FISH。3+的不用做FISH，可以直接用靶向辅助治疗。0、1+的患者若经济条件许可，可以建议做FISH。
最后来看一下FISH做出来的结果图，左边是HER2扩增阴性右边是阳性，HER2检测过程中常用到两种探针，着丝粒探针是检测着丝粒观察对应染色体的个数，外加目的探针直接检测目的基因HER2，通俗的讲，阴性结果就一个着丝粒一个HER2基因，阳性就是一个着丝粒很多个HER2基因。
另外，ASCO会议指出晚期胃癌患者在确诊时都应接受HER2检测，而FDA于2010年10月批准Herceptin联合其他化疗药物用于HER2阳性的胃癌和胃食管交界处腺癌患者的治疗。
（二）“金标准”之ALK基因检测
认识ALK：是一种间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic Lymphoma kinase, ALK），强力致癌驱动基因。EML4-ALK基因重排（又叫ALK阳性）的肺癌是主要发生在非小细胞肺癌（NSCLC），约占肺癌3%-5%。
FDA 2011年批准克唑替尼上市，适应症为用于治疗间变淋巴瘤激酶（ALK）阳性的局部晚期或转移的非小细胞肺癌，同时伴随批准雅培Vysis的ALK FISH产品上市。
*使用ALK断裂探针的NSCLC FISH图
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上海衡道医学病理诊断中心 利用荧光原位杂交平台，开展包括乳腺癌中的HER2基因扩增筛查，提示曲妥珠单抗等靶向药物的敏感性，以及非小细胞肺癌中ALK基因融合检测，提示克唑替尼等靶向药物的敏感性，为患者和医生提供直观、科学的用药指导报告。
参考资料
[1].CamidgeD R, Kono S A, Flacco A, et al. Optimizing the Detection of Lung CancerPatients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene RearrangementsPotentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment[J]. Clinical Cancer Research,2010, 16(22): 5581-5590.